2005 Fiscal Year Annual Research Report
椎間板におけるplasmid vecterを用いたin vivoRNA干渉と応用
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17591570
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
西田 康太郎 神戸大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (00379372)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
土井田 稔 神戸大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (60237170)
秋末 敏宏 神戸大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (90379363)
黒田 良祐 神戸大学, 大学院医学系研究科, 助手 (80379362)
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| Keywords | 椎間板 / 腰痛 / 遺伝子治療 / 組織再生 / RNA干渉 / 超音波 |
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| Research Abstract |
外因性Reporter遺伝子(in vitro & in vivo)を用いた研究
基礎実験として、培養髄核細胞を用いてsiRNAとsiRNAをコードするplasmid(Vector based siRNA)をリポフェクション法にて遺伝子導入し、遺伝子発現の抑制効果期間を調査した。siRNAと比較して、Vector based siRNAにおいては、有意に長期間の遺伝子発現の抑制効果が得られた。
上記の結果をもとに、SDラット尾椎椎間板を用いたin vivo研究を行った。
麻酔下にラットの尾椎椎間板を展開し、直視下にplasmid遺伝子とマイクロバブルを混合したものを椎間板内に注入し、直ちに外部より超音波を照射して遺伝子導入を行った(超音波コントラスト法)。
定量的実験として、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼのreporter plasmidを同時に椎間板内に導入し、ホタルルシフェラーゼの発現抑制のみを標的としたsiRNAをコードするplasmidを同時導入した。経時的に椎間板組織を回収し、組織内のシフェラーゼ遺伝子発現を定量した。ウミシイタケルシフェラーゼを内因性コントロールとして、ホタルルシフェラーゼ発現が特異的にどれだけブロックされているかを両者の比を用いて統計学的に検討した(n=7)。Negative controlとして、siRNAを導入しないものと、RNA干渉は引き起こさないが同様の遺伝子内容(配列は異なる)を含むscramble siRNAをコードするplasmidを用いた。
遺伝子導入後2週間までの結果では約80%の特異的なホタルルシフェラーゼの発現抑制が観察された。発現抑制効果期間については現在調査中である。
これらの成果は、日本整形外科学会基礎および国際腰痛学会にて報告した。
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