神経芽腫に対するRNA干渉を用いた分子標的治療法の開発

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17591861
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 福澤 正洋 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (60165272)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 米田 光宏 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (30372618) ; 草深 竹志 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (70263267)
• Keywords: 神経芽腫 / MYCN / RNA干渉 / NB-1

Research Abstract

MYCN増幅細胞株であるNB-1を用い、MYCN塩基配列に特異的なsiRNAsを導入してRNA干渉を行う。siRNA導入後の細胞について、MYCN mRNA発現をreal time RT-PCRにて測定、ウエスタンブロッティングおよび免疫染色で蛋白発現を測定し、MYCN発現抑制を確認する。MYCN発現抑制後の細胞について、WST assayおよび細胞数の測定を行い、細胞増殖能の変化を検討する。またMYCN発現抑制後の細胞の形態学的変化、アポトーシスの亢進の有無、Trk Aの発現変化を検討する。
MYCN mRNAの発現レベルは約30%以下まで抑制された。またウエスタンブロッティングでも発現抑制が認められ、免疫染色でもsiRNA導入後は有意に核の染色が減弱した。以上により、RNA干渉によりMYCN発現がmRNAおよび蛋白レベルで抑制された。
さらに細胞増殖能の検討により、MYCN発現抑制後の細胞は、WST assayおよび細胞数測定により有意に増殖能が抑制されることが明らかとなった。さらにこの細胞をTUNEL法で検索すると、アポトーシス陽性細胞が多数認められた。導入前後の形態学的変化として神経突起の伸長が観察され、同時にTrkAの発現が有意に亢進していた。
以上によりMYCN増幅細胞であるNB-1に対し、RNAi干渉を用いることにより、MYCNの発現を30%以下まで抑制した。MYCNの発現抑制により、細胞増殖抑制・アポトーシスの亢進および細胞分化が誘導された。