2005 Fiscal Year Annual Research Report
口腔癌における癌抑制遺伝子INGファミリーの機能解析
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17591911
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
MEHMET Gunduz 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (70333507)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永井 教之 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 教授 (90085770)
長塚 仁 岡山大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助教授 (70237535)
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| Keywords | 口腔癌 / 癌抑制遺伝子 / INGファミリー / p53 / アポトーシス / 機能解析 |
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| Research Abstract |
口腔癌は複数の癌関連遺伝子に生じた遺伝子変化が蓄積した結果生じる。そこで今回我々は以前同定したINGファミリー癌抑制遺伝子のING1b、ING1cまたはING3の機能解析を仕始めた。
まずそれぞれの遺伝子のmRNA発現をRT-PCR法によって調べた。PCR産物のバンドの濃度はコンピューターソフトにより定量しました。その結果ING1bの発現は口腔癌組織で30%低下していたが、ING1cの場合は58%であった。ING3は50%での癌サンプルで正常に比較し低下した。
次に制限酵素に基づいてメチル化アッセイではING1bは51%の癌サンプルでメチル化を認めたが、ING1cの場合はなかった。この結果ING1のsplicingバリアントの機能と不活性メカニズムは違うと考えられた。さらに組織レベルでp53変異ステイタスを調べたところでだいたい40%の癌サンプルでミュウテイションを見られた。現在ミュウテイションステイタスとINGファミリー遺伝子の発現関連を検討している。それぞれのINGファミリー遺伝子のp53依存的と非依存的経路について成果を得られると考えられます。
さらにそれぞれのINGファミリー遺伝子の機能解析について検討している。これのために培養細胞SCCKN, SCCTF, T3M1を購入し、ING1とp53のミュウテイションまたは発現レベルをDNAレベルでそれぞれのエクソンのPCR-ダイレクトシーケンスによって調べた細胞全株p53変異が認めた。一方ING1の場台遺伝子変異はなかった
この細胞株に以前に作成したFlagをタッグしているING1bまたはING1cベクターを単独、併用またはp53発現ベクターと同時にトランスフェクションして、MTTアッセイ、trypan blue dye exclusionアッセイによって細胞増殖、TUNNELまたはFACS解析によってアポトーシスを検討している。予備的結果はそれぞれのINGファミリー遺伝子が細胞増殖を抑制し、アポトーシスを誘導していた。次の段階として、メカニズム解析としてsiRNAによって抑制実験またはp53関連について免疫沈殿の実験を予定している。
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