2005 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子導入フィーダー細胞を用いた外分泌腺幹細胞培養法の確立および治療への応用
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17591930
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| Research Institution | Tsurumi University |
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Principal Investigator |
美島 健二 鶴見大学, 歯学部, 助教授 (50275343)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
斎藤 一郎 鶴見大学, 歯学部, 教授 (60147634)
井上 裕子 鶴見大学, 歯学部, 講師 (50367306)
山田 耕一 鶴見大学, 歯学部, 助手 (60367307)
坪田 一男 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (40163878)
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| Keywords | 唾液腺 / 再生医療 / 口腔乾燥症 / SP細胞 |
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| Research Abstract |
本研究では口腔乾燥症治療に組織幹細胞を用いた再生医療を応用すべく、マウス唾液腺から組織幹細胞に富んだ分画として知られるside population cell(SP細胞)と対照としてmain population cell(MP細胞)をflow cytometryにより採取し、それらの発現遺伝子の差をDNA microarrayを用いて網羅的に解析した。このことにより唾液腺における組織幹細胞の未分化状態の維持あるいは分化誘導因子の同定が可能となる。本年度はC57BL/6マウス(6週齡)10匹より唾液腺組織を摘出後、コラゲナーゼおよびヒアルロニダーゼ処理後トリプシンを用いて細胞を分散化しFACS Vantage(自動細胞分離装置:フローサイトメトリー)によりHoechst33342(-)のSP細胞と対照としてMP細胞を検出し、これらの分画に存在する細胞を採取した。この際SP細胞がレゼルピン処理によりHoechst33342(+)に移行することを、あわせて確認した。次に、採取したSP細胞およびMP細胞からPicoPureRNA isolation kit(Arcturus)を用いてRNAを抽出しRiboAmp RNA amplification kit(Arcturus)を用いてT7poymerase-based methodによりRNAを増幅した。(本法ではRNAをlinearに増幅する方法なので増幅したRNAは以後のDNA microarrayを用いた解析に用いることが可能であった。)SP細胞およびMP細胞から増幅したRNAからcDNAを合成しCy3あるいはCy5による蛍光標識を行いNIAマウス15K cDNA array(Version2)上で競合ハイブリさせsignalを検出した。さらに、統計解析の結果からMP細胞と比較してSP細胞に有意に発現が高いことが明らかとなった遺伝子が同定され、同定された遺伝子の中から比較的発現量に差の認められたクラステリンについてRT-PCRおよびReal-time PCRによりSP細胞特異的に発現が高いことを確認した。次に、クラステリンの詳細な機能を解析する目的でPCRにより増幅したクラステリン全長cDNAを遺伝子発現ベクターであるpCAGS-puro(理研、丹羽博士より供与)に挿入した。作製したプラスミドをマウスの胎児線維芽細胞株であるSTO細胞に導入し、さらに薬剤による選択を行うことによりクラステリンを恒常的に発現する細胞株(STOclu)を樹立した。
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