2005 Fiscal Year Annual Research Report
短期硬組織再生誘導を目指した三次元培養自己細胞移植システムの創製および臨床応用
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17591996
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
池田 毅 長崎大学, 医学部・歯学部附属病院, 助手 (90244079)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
柳口 嘉治郎 長崎大学, 医学部・歯学部附属病院, 講師 (50264255)
大原 直子 長崎大学, 大学院・医歯薬学総合研究科, 助手 (80301365)
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| Keywords | キトサン / 硬組織再生 / 培養骨芽細胞 / cDNAマイクロアレイ / ALP / osteocalcin / BMP-2 / リアルタイムPCR |
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| Research Abstract |
本年度は、自己細胞の移植による迅速な硬組織再生を目標として、骨芽細胞機能亢進に関与する遺伝子群の確認・評価を行った。すなわち、キトサン添加による培養骨芽細胞のALP活性上昇時に応答しているmRNA解析のため、cDNAマイクロアレイを利用した遺伝子クローニングの結果、発現増強が確認されたものに対して、リアルタイムPCR法によるcDNAの厳密な定量分析を実施した。
まず6週齢雄性Wistar系ラット下顎骨または大腿骨から骨髄液を穿刺・採取し、ラット血清を添加した培地で継代培養操作を行い、この際、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を誘導する目的で、α-MEM培地にDexamethazonおよび生理活性物質としてキトサン溶液を添加した。その結果、キトサン濃度0.002mMを添加することによって100mmの培養皿1×10^6cells播種すれば約14日後にコンフルエントとなることが確認できた。
次いで、間葉系幹細胞から骨芽細胞への分化に関して、ALP, Type I collagen, osteocalcinおよびBMP-2をターゲットとして、それらのmRNAの発現増強について検討を行った。培養細胞の形態変化(大型化)を倒立培養顕微鏡下で確認後、RNAを回収し、これをもとに前述したターゲット遺伝子に特異的なプライマーを用いてRT-PCRを行ったところ、osteocalcinおよびBMP-2において有為に遺伝子発現の増強がみられた。また、形態学的にもALP免疫染色、von kossa染色およびアリザリンレッド染色にて石灰化様分泌物が確認できた。
さらに、水溶性キトサンによる骨芽細胞における石灰化機能亢進に影響する遺伝子群の同定・評価を行うために培養細胞からtRNAを回収し、ルシフェラーゼRNAを添加した後、小型全自動核酸精製装置を利用し、蛍光ラベリングされたcDNAを回収した。これらmRNAに相当するcDNAを合成するために特異的プライマーを設計しPCR法にて増幅し、この増幅産物をリアルタイムPCR装置にて、現在、直接連続的に定量分析検討中である。
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Research Products
(1 results)
