2005 Fiscal Year Annual Research Report
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17592103
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| Research Institution | Dokkyo Medical University |
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Principal Investigator |
川又 均 獨協医科大学, 医学部, 助教授 (70224847)
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| Keywords | p53 / 癌原性変異 / p73 / p53標的遺伝子 / ルシフェラーゼアッセイ |
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| Research Abstract |
(1)口腔癌由来癌原性p53遣伝子(HNt-p53:Glu17Lys,His193Leu,BHY-p53:delta121,TYS-p53:Asp281His)をヒト骨肉腫細胞(Saos-2)にトランスフェクションした.トランスフェクション12時間後から6時間アドリアマイシン(5μg/ml)で処理を行い細胞にDNA障害を与え、細胞抽出液を調整し、p53リン酸化抗体によるWestern blottingを行った.
(2)野生型p73のcDNAにFlagのタグを付けた遺伝子をサイトメガロウイルスIEプロモーターにより発現誘導できる発現ベクターは既に構築しており,上述のSaos-2細胞でp73が発現することは確認している.また,野生型p53の標的遺伝子(p21waf1,MDM2,BAX,p53AIP1,PUMA)のp53反応性領域をを保有する種々のレポーター遺伝子を保有しており,Saos-2細胞において過剰発現p73がこれらのプロモーターを活性化するか否かをルシフェラーゼアッセイにて検討した.また,上述の口腔癌培養細胞由来癌原性p53を,野生型p73とSaos-2細胞に共発現させることにより,p73のp53標的遺伝子に対する転写活性化能の変化について検討した,
(3)上記ルシフェラーゼアッセイで調整された細胞抽出物を用いて,野生型p73と癌原性p53の結合活性について検討する.まず,抗Flag抗体で免疫沈降を行い,発現させた野生型p73を回収する.その免疫沈降物をSDS-PAGEを行い,p53抗体によりWestern blottingを行い,口腔癌由来癌原性p53が野生型p73と結合しうるか否か,またその転写活性化能に影響を与えるか否かを検討している.
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Research Products
(5 results)
