2005 Fiscal Year Annual Research Report
トランスジェニックマウスにおける導入遺伝子コピー数の測定法の開発と応用
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17650123
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research |
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Principal Investigator |
米川 博通 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 参事研究員(副所長) (30142110)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
多屋 長治 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (90175456)
設楽 浩志 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (90321885)
石井 里絵 (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (00425688)
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| Keywords | 実験動物学 / トランスジェニックマウス / 系統維持 |
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| Research Abstract |
実験材料となるTgマウスとして、すでに系統の樹立されたmtGFP-,mtDsRed2-Tg系統を用いた。それぞれの系統については、ヘミ接合体として系統維持されている。ホモ接合体を得るために、ヘミ接合体同士の交雑を行い、ホモ・ヘミ接合体および野生型マウスの鑑定法を用いて3者を区別した。必要とする数のホモ・ヘミ接合体を得るために、体外受精等の発生工学的手法および前述鑑定法を用いて産仔数を整えた。得られたホモ・ヘミ接合体より尾を採取し、総DNAを調整することでリアルタイムモニタリングPCR法による解析時の試料とする。
測定の対象となる導入遺伝子として、上記Tg系統のEGFPおよびDsRed2を標的遺伝子とした。測定法として、TaqManプローブまたはSYBR-Greenを用いたリアルタイムモニタリングPCR法と、その解析のために内在性コントロールを基準として対象となる遺伝子量を算出する相対的定量法(ΔΔCt法)を採用した。標的遺伝子(EGFPおよびDsRed2)と内在性コントロール用遺伝子のそれぞれのプライマー・プローブセットによるPCR効率がほぼ100%となるように、試料DNAの希釈系列を作製および標準曲線による解析等により、条件の最適化を行った。また、標的遺伝子と内在性コントロール用遺伝子のそれぞれの反応効率がほぼ等しく、ΔΔCt法による測定が可能か否かを検討するために、近似曲線を用いた解析を行い、構築した測定条件による解析が有効であることを確認した。
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