担子菌の標的遺伝子を高効率かつ高選択性をもって破壊する方法の開発

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17651110
• Research Institution: Saitama University
• Principal Investigator: 畠山 晋 埼玉大学, 科学分析支援センター, 講師 (00396665)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 井上 弘一 埼玉大学, 大学院理工学研究科, 教授 (60114203)
• Keywords: 担子菌 / 遺伝子導入 / KU70 / 非相同末端結合

Research Abstract

1.Phanerochaete chrysosporiumのおける非相同末端結合関連遺伝子のクローニング
平成17年度において、非相同末端結合に関わる遺伝子をゲノムデータベースを用いて探索したところ、K70、K80、Lig4のホモログの存在が明らかとなった。この遺伝子を含むゲノムDNAのクローニングをPCR法によって行なった。現在、下で述べるマーカーをこの遺伝子の読み枠に挿入し、相同的組み換えによる遺伝子破壊のためのコンストラクトを作製している。
2.遺伝子導入ベクターの開発
Phanerochaete chrysosporiumにおいて構成的に発現している、GPD遺伝子(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)のプロモーター領域とターミネーター領域をクローニングし、これらによってハイグロマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子を挟み込んだコンストラクトを作製した。このDNA断片をマーカー遺伝子として用い、遺伝子破壊のためのマーカー、および、遺伝子導入方法の最適化のための形質転換実験に用いた。
3.遺伝子導入方法の検討
3-1 コロニー形成培地の検討
Phanerochaete chrysosporiumの遺伝子導入を確認するために、容易に観察できるコロニーを形成できる培地の組成を検討した。その結果として、糸状菌の最小培地として用いられるVogelの培地をベースにした培地が良好なコロニーを形成した。さらにソルボースとトリプトンの濃度を最適化した。また、薬剤耐性の選択において用いるハイグロマイシンの濃度も最適化し、形質転換体を選択するための培地条件の最適化に成功した。
3-2 電気穿孔法による遺伝子導入の最適化
担子菌の遺伝子導入において一般的ではない電気穿孔法の条件を最適化した。アカパンカビにおける電気穿孔法の条件から、電圧、抵抗を段階的に変化させて遺伝子導入の最適条件を探索した。また、Phanerochaete chrysosporiumの分生子の発芽時間と菌糸細胞壁の再生時間がリンクするという予想のもとに復帰培養に要する時間の検討も行なった。その結果として、電気穿孔法による遺伝子導入から復帰培養についての最適時間を決定することができた。