2005 Fiscal Year Annual Research Report
ブリッジヌクレオチド法による遺伝子cDNAの迅速(1日以内)クローニング法の開発
Project/Area Number |
17651113
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Research Institution | Kobe University |
Principal Investigator |
榎本 平 神戸大学, 発達科学部, 教授 (00127622)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
綾木 仁 神戸大学, 医学研究科, 助教授 (80222701)
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Keywords | cDNA / 遺伝子クローニング / oligo (dG) latex bead |
Research Abstract |
Blue colony(pGBM),white colony(pCY)を形成するplasmidを用いたモデル実験の結果: 1)Bridging nucleotide(BN)とoligo(dG)latex beadのoligo(dG)の塩基配列の長さについての検討 BNの遺伝子特異的DNAの塩基配列を10塩基〜100塩基まで変化させ、pCYのクローニング効率を測定したところ、20塩基まではほとんどクローニング効率は0に近いが、25から30塩基で劇的に変化し、30塩基でもっともクローニング効率が高かった。50塩基以上だとむしろ減少傾向を示した。 2)クローニング効率へのblocking sequence(BS)の効果の検討 BN-beadへの目的遺伝子plasmidのクローニング効率を上げるための手段として、BNの遺伝子特異的配列の近傍の上流及び下流と相補的な1本鎖オリゴDNA(blocking sequence(BS))を用いて検索したところ、BSのBNからの距離とBS自体の長さ及びその濃度がクローニング効率に劇的な効果をもたらすことを発見した。BSのBNからの距離は0kら5塩基までは効果的だが、7塩基以上離れるとその効果は激減した。また用いるBSの塩基の長さも20塩基長まではほとんど効果がみられないが、30塩基以上特に30から35塩基で、BS非存在の場合と比較して千から1万倍の高いクローニング効率を実現した。さらに、反応液を加えるBSの濃度も非常に重要で、10μM以下ではまったく効果なく、20uM以上特に100uM以上でクローニング効率を劇的に上昇させた。 3)cDNA library plasmidの存在形態の検討 plasmidは、通常super, open, linearの3つの存在形態をとるが、これらが目的の遺伝子plasmidのクローニング効率にどのように影響するかを、3つのplasmid存在比を変動させて調べた。その結果、クローニング効率はsuper-coil型plasmidの存在量に依存して変動すること、openやlinearタイプの混入はクローニング効率を激減させることが判明した。
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Research Products
(1 results)