2005 Fiscal Year Annual Research Report
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17655035
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| Research Institution | Nagasaki University |
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Principal Investigator |
甲斐 雅亮 長崎大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 教授 (00160953)
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| Keywords | プロテインチップ / 蛍光検出反応 / ペプチド認識反応 / カテコール試薬 / ホウ酸塩試薬 / ペプチドホルモン / 新規蛍光反応 / ペプチド検出 |
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| Research Abstract |
本研究の目標は、ペプチドホルモンの新しいプロテインチップ検査手法を開発するために、本研究代表者らが最近見出した、ペプチドのN末端アミノ酸のアミノ基と隣接ペプチド結合を特異的に認識できる蛍光反応を化学的に解析し、ペプチドの特異的な高感度蛍光検出法を構築することである。
本年度の研究では、まず、試験管を用いて、この反応(カテコールとホウ酸塩試薬を使用する)のペプチドに対する最適蛍光誘導体化反応条件を検討した。その結果、プレカラムHPLC蛍光検出法により、ピコモルレベルのペプチドが特異的かつ定量的に検出できることが分かった。また、数種のペプチドから生成する蛍光体を逆相HPLCによって分離した結果、各ペプチドから生成する蛍光体はペプチドの疎水性に順じて分離されたので、蛍光体の分子構造はそれぞれ異なることが示唆された。次に、生成するペプチド蛍光体の化学構造を推定するために、蛍光物質を逆相HPLCによって分離し、ESI-TOF/MSを試みた。この際、蛍光物質がホウ酸イオンと錯体を形成していることが考えられたため、反応物をMSで検出したが、その分子イオンの検出は困難であった。したがって、生成物がホウ酸イオンと錯体を形成していない分子構造を解析した結果、N末端アミノ酸のアミノ基と隣接ペプチド結合の窒素原子に2分子のカテコールが脱水縮合し、かつ酸化された分子構造が推察された。これらの蛍光物質は、水溶液中にホウ酸塩が存在すると蛍光を強く発し、4℃保存で少なくとも72時間は安定であった。このことは、生成した蛍光物質がホウ素錯体を形成している分子構造であると推定できた。今後、この反応をプロテインチップ検出に応用するために、PVDF膜上でのペプチドホルモンを蛍光検出する最適化条件を設定する。
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