2005 Fiscal Year Annual Research Report
FRETとFRAPによる脂溶性リガンド分子と受容体結合の可視化と分子相関解析
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17659057
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
河田 光博 京都府立医科大学, 医学研究科, 教授 (60112512)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松田 賢一 京都府立医科大学, 医学研究科, 講師 (40315932)
二木 史朗 京都大学, 化学研究所, 教授 (50199402)
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| Keywords | 脂溶性リガンド / FRAP / 分子相関 / FRET / 受容体 / 培養 / セミインタクト細胞 / 強制発現 |
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| Research Abstract |
本研究では、ステロイドホルモンをはじめとする脂溶性リガンド分子の化学的蛍光標識を行い、その受容体との分子相関をリアルタイムで可視化することを目的とした。エストラジオールとジヒドロテストステロンを、リンカーを介してOH基に低分子蛍光物質BODYPY-TMあるいはAlexa 546を化学的に標識させた。蛍光標識されたこれらの脂溶性シグナル分子を、エストロゲンレセプター(ERα/β)、アンドロゲンレセプター(AR)、のプラスミドをMMTV-Lucとともにトランスフェクションさせた培養細胞にマイクロインジェクション法で注入、あるいはジギトニン処理したセミインタクト細胞の培養液に添加した。事前にこれらの蛍光標識シグナル分子受容体が転写活性を有しているのかどうか確認した。まず、各種培養細胞(内因性受容体を有しない細胞:COS-1,HeLa、内因性受容体を有する細胞:MCF7,LNCap,GT1,初代培養神経細胞:海馬、視床下部、大脳皮質)にこれらの受容体融合遺伝子を導入してタンパクの発現を行わせ、リガンド添加による蛍光像の変化を、現在最もスペック機能が優れている共焦点レーザー顕微鏡(Zeiss LSM-510META)、CCDカメラ設置蛍光顕微鏡を用いて観察するための条件検討を行った。受容体を強制発現させていない細胞をセミインタクト化し、培養的に標識リガンドを添加しても、セミインタクト細胞には標識リガンドの存在を認めなかった。しかし、受容体を強制発現させた細胞をセミインタクト化し、培養液中に標識エストロゲンを添加すると、標識リガンドは核に集積することが判明した。次に、非標識リガンドとの競合実験を行った。
以上から、セミインタクト細胞での検索を終え、予想通りの結果を得たので、次年度はマイクロインジェクション法による解析を進める予定である。
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