2005 Fiscal Year Annual Research Report
循環系のオーファン受容体を特異的に細胞内移行させる未知の生理活性ペプチドの探索
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17659234
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
桑迫 健二 宮崎大学, 医学部, 助手 (20381098)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北村 和雄 宮崎大学, 医学部, 教授 (50204912)
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| Keywords | 生理活性ペプチド / オーファン受容体 / 細胞内移行 / 遺伝子構築 / 安定発現系 / FACS解析 / 新規アッセイ法 |
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| Research Abstract |
クラスBのG蛋白共役型受容体(GPCR)のリガンドはペプチドである。したがって、我々はこのクラスに属するオーファン受容体を標的にし、そのリガンドの同定を目指している。これまでの研究の進行状況は極めて順調であり、下記の(1)-(5)の成果を得ることができた。
(1)独自にデザインしたプライマーを用いてRT-PCRを行い、ヒトの循環系の臓器(心臓/肺/腎臓/副腎)に高発現している2つのオーファン受容体を選定した(GPCR_AおよびGPCR_B)。
(2)PCR法により、それらの遺伝子(完全長)を獲得した。
(3)各遺伝子のシグナル配列の直後にV5タグを付加し、さらに終止コドンを欠如させた3'端にGFP遺伝子を融合させて、発現ベクター(pCAGGS/Neo ; Kuwasako et al.(2000)J.Biol.Chem.)に組み込んだ。
(4)リポフェクタミン法を用いて、それらの融合遺伝子(V5-GPCR_A-GFPおよびV5-GPCR_B-GFP)をHEK-293細胞(当該研究に最も適した培養細胞)に導入し、G418(ネオマイシン)による薬剤選別を行った。数週間後に、二重染色を行い、V5タグとGFPが共発現しているクローンをそれぞれ3つずつ獲得した(標的受容体の細胞膜発現は、FACS解析で定量した)。
(5)当教室で確立した方法を駆使して、ブタ/ウシの組織(心房/心室/肺/副腎)を抽出した。今後、得られた組織抽出液を逆相HPLC、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過などに適宜展開して、リガンドを精製していく予定である。
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