特発性間質性肺炎に関係する新しいウイルス遺伝子のクローニング

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17659249
• Research Institution: Research Institute, International Medical Center of Japan
• Principal Investigator: 土方 美奈子 国立国際医療センター(研究所), 呼吸器疾患研究部・ウイルス性呼吸器疾患研究室長 (90332387)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 慶長 直人 国立国際医療センター(研究所), 呼吸器疾患研究部, 部長 (80332386)
• Keywords: ウイルス / 遺伝子 / 感染症

Research Abstract

国立国際医療センター倫理委員会において、課題名「特発性間質性肺炎に関連する新しいウイルスの探索について」代表者:土方美奈子として本研究内容に関する審査を受け、平成17年7月14日に承認を受けた。
国立国際医療センター受診の特発性間質性肺炎患者から、上記倫理審査の内容に基づき、文章による説明と同意取得を行った上で、血清の提供を受けた。(慶長直人 分担)
血清を遠心処理・フィルター処理・DNase処理した後に、核酸抽出を行い、reverse transcription、2^<nd> strand synthesisを行い、2本鎖DNA化を行った。制限酵素MboIでDNAを消化し、Lisitsynらの原法に従ってアダプターライゲーションを行い、PCR増幅を行った。PCR後にbandが認められた場合に、もとの核酸がDNAかRNAか判定が出来るように、核酸抽出はRNA抽出法であるTrizolLSを用いたものとRNA/DNAを抽出するExR&Dを用いたものの2種類、reverse transcription、2^<nd> strand synthesisそれぞれの有無で1検体につき8通りの操作を行った。また、PCR増幅はターゲットの増幅サイズが短い場合と長い場合に対応できるように、AmpliTaq GoldとTaKaRa LA Taqの2種類を用いて試みた。その結果、1検体でRNA由来と思われる約600bpの増幅産物が認められたが、アガロースゲル上で見られるバンドは薄かった。本法ではスタート時のウイルス量が充分でないと増幅産物が得られない。今回はAllanderの方法の通りに50μlで行ったが、今後、血清の量を増やす、ウイルス濃縮を行う、の2方法を追加して行う予定である。(土方美奈子 分担)