新たに開発されたレドックス・プローブをもちいた新しい臓器機能評価法の開発

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17659396
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 尾崎 倫孝 北海道大学, 大学院・医学研究科, 寄附講座教員 (80256510)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 藤堂 省 北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (60136463) ; 末松 誠 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (00206385)
• Keywords: 酸化ストレス / 低酸素・再酸素化 / GFP

Research Abstract

レドックス感受性プローブ
細胞内GSH/GSSG比を反映するレドックス感受性プローブは、GFP (Green Fluorescent Protein)をもとに作られ、細胞内の生理的あるいは病的状態における、酸化あるいは還元状態に発光強度が変化する。プローブは、現在プラスミドからアデノウィルスベクターを作成中である。
細胞導入実験
プラスミドを用いて、Hela細胞(ヒト扁平上皮癌細胞株)、AML12(非腫瘍性肝細胞株)にtransient transfectionし、プローブ蛋白を発現させた。(3.5cmガラスボトムディッシュにsemi-confluentとなるように細胞をまき、1.5ugのDNAを用いた。その後、共焦点レーザー顕微鏡にて観察し発現を確認した。[400nmおよび480nmの2波長にてそれぞれ励起し、535nmの吸収を観察])
a)まず、酸化剤(aldrithiol)および還元剤(DTT)を投与し、細胞内に発現したroGFPプローブが予想通りに機能するかどうかを確認した。roGFPは、酸化剤・還元剤により変化し、この変化は可逆的であった。
b)このプローブか細胞実験系で機能することを確認した後、これら細胞を使って、低酸素・再酸素化ストレスをくわえる実験をおこなった。この刺激は、酸化ストレスを誘導する刺激のひとつであるが、48時間前にplasmidにてtransfectしておき、低酸素状態1-4時間のストレスを加え(酸素濃度1%以下)、その後再酸素化(酸素濃度21%)した。その結果、低酸素中、細胞内は徐々に還元状態に傾くが低酸素状態が2時間を越えると酸化ストレスがかかることを観察した。再酸素化後は一気に酸化的ストレスがかかり、そのピークは10-15分後にあり、60分以内に酸化ストレスはベースラインに戻ることが観察された。