ラット嗅板細胞を用いたGnRHパルス分泌におけるcAMPの役割に関する研究

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17659519
• Research Institution: Yokohama City University
• Principal Investigator: 榊原 秀也 横浜市立大学, 医学部, 準教授 (60235140)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 平原 史樹 横浜市立大学, 大学院医学研究科, 教授 (30201734) ; 舩橋 利也 横浜市立大学, 医学部, 準教授 (70229102) ; 吉田 浩 横浜市立大学, 医学部, 助手 (50405007)
• Keywords: 神経内分泌学 / GnRHパルス / cAMP

Research Abstract

1)GnRHプロモーター作動性Adenovirus Vectorの作成、精製、力価測定
ラットGnRHプロモーターおよびPDE4D1 cDNAを発現させるアデノウイルスをClontec社のAdenoX Expression Systemを用いて作成し、精製後にHEK293細胞に段階希釈したウイルスを感染させて力価を測定した。コントロールとしてCNG A2 specific siRNAを発現させるアデノウイルスを同様に作成して用いた。
2)GnRH神経細胞における導入遺伝子の特異的発現の検討
作成したアデノウイルスの特異的発現を検討するために、まずGnRH分泌培養細胞であるGT1細胞に感染させ、PDE4D1およびCNG A2 specific siRNAの発現をPCR, Western blot,免疫染色で確認した。
3)蛍光カルシウム試薬によるCalucium Oscillationの観察
アデノウイルスに感染させたGT1細胞に蛍光カルシウムインジケーターであるFura2を用いてCalucium Oscillationを観察したところ、導入した遺伝子の作用によりCalucium Oscillationの減少が認められた。
4)GnRHパルスの観察
アデノウイルスに感染させたGT1細胞のGnRHパルスを還流実験により測定した。細胞外還流液を4分から6分間隔で採取してGnRHをEIA法により測定したところ、導入した遺伝子の作用によりパルス間隔の延長が認められた。