蛋白質相互作用解析に基づく新規難聴関連分子の探索とヒト難聴モデルマウスの作製

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17680034
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture
• Principal Investigator: 吉川 欣亮 東京農業大学, 生物産業学部, 助教授 (20280787)
• Keywords: stereocilia(不動毛) / ヒト難聴モデルマウス / Sans / Whirlin / Harmonin / Gnd211 / p55 / バンド4.1

Research Abstract

内耳有毛細胞の不動毛の発生・維持に関与する新たな分子の同定、さらに、新規ヒト難聴モデルマウスの樹立を目的として解析を行い、以下の結果を得た。
1.内耳有毛細胞で機能する新規スカフォールド蛋白質に相互作用する蛋白質の探索および同定
SANSおよびWhirlinをbaitとして酵母2-hybrid法によりスクリーニングした蛋白質との相互作用をGST Pull-downアッセイにより検証した。その結果、新たに膜蛋白であるItm2aがSANSとin vitroで相互作用することが明らかとなった。次にItm2aのペプチド抗体を作成し、有毛細胞における局在を調査した結果、不動毛での発現は認められなかったが、動毛で強い発現を示した。また、Harmoninと相互作用する蛋白質の2-hybridスクリーニングを行った結果、6種の蛋白質が単離された。
2.4.1蛋白質の発現パターンの解析
本研究において、WhirlinがMAGUKファミリーのp55およびCASKが結合し、さらに、それらを介して4.1ファミリーの4.1Rおよび4.1Nとコンプレックスを形成することが明らかとなった(PNAS2006)。そこで他の4.1ファミリーに属する4.1Gおよび4.1Bについても発現解析を行った。その結果、両者ともに有毛細胞での局在が明らかとなり、4.1Gは核膜に、4.1Bは不動毛および細胞質と聴神経とのジャンクションで特異的に発現することが明らかとなった。
3.4.1Rノックアウト(KO)マウスの解析およびp55 KOマウスの作製
Whirlinとp55を介してコンプレックスを形成することが明らかとなった4.1R KOマウスの内耳表現型を電子顕微鏡により観察した結果、不動毛において異常は認められなかった。しかしながら、野生型と比べ、4.1R KOマウスでは聴力の低下が認められ、約60dBの閾値を示した。また、p55 KOマウスを作製するため、ターゲッティングベクターをES細胞に導入し、2ラインの変異細胞株を得た。

Research Products

• [Journal Article] Fine mapping of Ahl3 affecting both age-related and noise-induced hearing loss. (2007)
  • Author(s): Morita, Y., Hirokawa, S., Kikkawa, Y, Nomura, T., Yonekawa, H., Shiroishi, T., Takahashi, S., Kominami, R.
  • Journal Title: Biochem. Biophys. Res. Common. 355・1 Pages: 117-121
• [Journal Article] The cis-Regulatory Element Gs15 Is Indispensable for Proximal Straight Tubule Cell-specific Transcription of Core 2 beta-1,6-N-Acetylglucosaminyltransferase in the Mouse Kidney. (2006)
  • Author(s): Sekine, M., Taya, C., Shitara, H., Kikkawa, Y., Akamatsu, N., Kotani, M., Miyazaki, M., Suzuki, A., Yonekawa, H.
  • Journal Title: J. Biol. Chem. 281・2 Pages: 1008-1015
• [Journal Article] Whirlin complexes with p55 at the stereocilia tip during hair cell development. (2006)
  • Author(s): Mburu, P.*, Kikkawa, Y.*, Townsend, S., Romero, R., Yonekawa, H., Brown, S.D.M.*P.M., Y.K.contributed equally to this work.
  • Journal Title: Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103・29 Pages: 10973-10978
• [Book] 内耳病態の解明と展開-分子遺伝学の立場より-III.2 Whirlerマウス(不動毛形成障害) (2006)
  • Author(s): 吉川欣亮, Mburu, P, 米川博通, Brown, S.D.M.
  • Total Pages: 8
  • Publisher: 東京医科歯科大学 耳鼻咽喉科(編集 喜多村 健)