2005 Fiscal Year Annual Research Report
先天性筋無力症におけるアセチルコリンレセプターαのsplicing異常の解析
Project/Area Number |
17700347
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Research Institution | Nagoya University |
Principal Investigator |
増田 章男 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (10343203)
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Keywords | 遺伝子 / RNA / 筋無力症 / スプライシング / 神経科学 |
Research Abstract |
AChRのαサブユニットをコードする遺伝子CHRNA1上のinframe exonであるP3Aのalternative splicingを制御する因子の同定および機能解析を行っている。 P3Aのalternative splicingを生じるαIVS3-8G→A mutationを解析した。 変異配列とその前後20bpを含んだoligo DNA(41bp)およびその対象として同一部位の正常配列より、in vitro transcription法によりRI標識したCTPを取り込ませながらprobe RNAを合成した。HEK293、C2C12、Hela細胞より抽出した核タンパクとprobeを混合し、probeと核タンパクを結合させた。UV cross-link後、SDS-PAGEを行いautoradiographyにより確認したところ、いずれのlysateでも約60kDaのところに変異群に見られず対照群に現れるバンドが認められた。 RNA配列および分子量から、この60kDaの結合タンパクはpolypyrimidine tract binding protein (PTBP)である可能性が示唆された。 次に、抗PTBP抗体を用い、上記のUV cross-linkしたsampleを免疫沈降し、SDS-PAGEを行ったところ、この抗体により60kDaのタンパクが免疫沈降されることが確認された。 以上により、αIVS3-8G→A mutationによるalternative splicingはPTBPによる制御を受けることが示唆された。 現在、PTBPのdeletion mutantの発現plasmidを作成し、このalternative splicingに関わるdomainを同定中である。
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