2005 Fiscal Year Annual Research Report
天然mRNAを利用した全長蛋白質ディスプレーと蛋白質相互作用解析
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17750157
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
山東 信介 京都大学, 工学研究科, 助手 (20346084)
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| Keywords | リボソーム / ディスプレー / 試験管内進化 / 網羅的 / 非翻訳領域 / tRNA / mRNA / 探索 |
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| Research Abstract |
天然型mRNAを荷札として用い、かつ、全長蛋白質を提示できる改良型リボソームディスプレー法の開発を目標とする。具体的には、終止コドンを読み飛ばし、その後に続く非翻訳領域をリンカーとして利用可能な改変翻訳系の構築を目指した。まず、原核系翻訳システムにおけるコンセプトレベルでの具現化を行った。市販の蛋白質翻訳溶液を用いたT7-tagセレクション系を構築した結果、RNAの安定性、リボソームディスプレー後のRNA回収率から再構成蛋白質翻訳系が最も本目的に適していることが確認された。また、3種の終止コドンを効率的に読み飛ばすことが可能なサプレッサーtRNAの探索を行った。面倒な化学的アミノアシル化過程を除去するため、内在性のアミノアシル化酵素によって効率的にアミノアシル化される終止コドンサプレッサーtRNAsの探索を行った。当初の計画に従いtRNALeuを基盤としたシステムの構築にチャレンジしたが、サプレッション効率、また、3種の終止コドンに対する適応性の点で効果が低いことが判明した。最終的にtRNAserを基本とする3種サプレッサーが本系の目的を満たすことを見出した(サプレッション効率向上のため、RF1-翻訳システムを利用した)。また、天然型と同じ配列の(かつ、様々な長さの)3'側非翻訳領域を有する擬似天然型Dihydrofolate Reductase mRNAを人工的に準備し、作成した改変翻訳系でのリボソームディスプレーを実施した。
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