2005 Fiscal Year Annual Research Report
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17770083
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
関根 俊一 東京大学, 大学院・理学系研究科, 講師 (50321774)
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| Keywords | 転写 / RNAポリメラーゼ / 転写終結 / X線結晶構造解析 / 立体構造 / Rho |
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| Research Abstract |
はじめに、高度好熱菌の菌体からRNAポリメラーゼ(RNAP)を単離し、高純度に精製した。RNAポリメラーゼと相互作用する転写因子(NusA、NusGおよびRho)を大腸菌内で大量に発現させるために、遺伝子のクローニング・発現系の構築を行った。これらのタンパク質を各々大腸菌で発現させ、高純度に精製することに成功している。つぎに、in vitroの転写終結実験を行い、精製された個々のタンパク質が実際にRNAPに対して機能することを確認した。
結晶化に向けてRNAPの転写終結複合体をin vitroで再構成するために、RNAPや転写因子に結合する核酸(RNAおよびDNA)の配列や長さをデザインした。精製されたこれらの核酸を用いて、RNAPや転写因子とのin vitroでの再構成実験を行い、いくつかの組み合わせで安定な複合体を形成させることができた。これらの複合体について結晶化に着手した。
再構成されたRNAP複合体について、X線解析に向けた結晶化のスクリーニングを行っている。また、転写終結因子Rho単独についても結晶化を行い、これまでに単結晶を得ている。これについては、大型放射光施設SPring-8を用いて2.8Åのデータセットの収集に成功している。現在このデータを用いて位相決定を試みている。
結晶解析と並行して、ここで挙げた転写因子とRNAPとの相互作用部位を特定するために、転写因子の変異体を作製し、RNAPとの結合実験を行っている。
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