銅イオンポンプATP結合領域のX線結晶構造解析

2006 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17770084
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 津田 岳夫 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 助手 (10345233)
• Keywords: 銅イオンポンプ / X線結晶構造解析 / ATP結合 / ATPase / イオンポンプ

Research Abstract

申請者は、重金属イオンポンプのATP結合様式を明らかにする目的で、銅イオンポンプATP結合領域のX線構造解析を行っている。本年度は、高度好熱菌由来の銅イオンポンプATP結合領域を含む組み換え蛋白質の結晶構造解析を行い、2.15Å分解能でATP類似体結合状態の初期の原子モデルを得ることに成功した。昨年度までの状況は、3.7ÅまでX線を回折する結晶は得られたが、条件を変えても思うように分解能が向上せず、さらにツインになり易いという性質もあり、構造解析に苦労していた。本年度に改良した主なポイントを以下に示す。
1、結晶化蛋白質試料
組み換え蛋白質のHisタグの付加部位やリンカーの長さ、発現コンストラクトに組み込む蛋白質の長さを変えた複数の組み合わせで発現・精製・結晶化スクリーニングを行った。その結果、あるコンストラクトで空間群の異なる良質な結晶を得ることができた。
2、構造解析
2006年1月に海外のグループがATPを結合していない状態の銅イオンポンプATP結合領域の構造を発表した。それを基にして、2つに分かれているドメインの傾きを変えた60個のサーチモデルを作製して分子置換法で初期モデルを得た。それと独立して、セレノメチオニン置換体の作製やヨウ素が付加したATP類似体を結合した蛋白質の結晶を用いたMAD法での解析を試みたが、上手く行かなかった。しかし、それらの異常分散効果を利用し、分子置換法で得られた初期モデルが性格性を確認でき、モデリングにも役立てた。
現在、モデルの精密化を進めており、重金属イオンポンプ独自あるいはATP結合蛋白質に共通のATP結合様式を理解し、論文を作成中である。