2005 Fiscal Year Annual Research Report
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17770169
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| Research Institution | Meiji University |
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Principal Investigator |
吉田 健一 明治大学, 農学部, 講師 (20345036)
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| Keywords | 分子生物学 / 転写因子 / 細胞周期 / 増殖・分化 |
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| Research Abstract |
新規細胞周期関連遺伝子として新たに見出されたCDCA遺伝子群の内、CDCA1〜CDCA5,CDCA7およびCDCA8の転写開始点近傍配列を、ヒトゲノムDNAよりルシフェラーゼ遺伝子の上流(pGL3-Basic)にクローニングした。塩基配列確認後、ヒト培養細胞HeLaなどにtransfectionし、ルシフェラーゼ活性を指標としたプロモーター強度を測定すると同時に、プロモーターのdeletion construct作製によるプロモーター活性を担う配列の特定、さらに、E2F1〜6の発現ベクターによるE2F-responsive-elementの同定を目指した。これらアッセイと併せて、E2F1強制発現後に回収したRNAを用いたRT-PCRの結果、CDCA遺伝子群の内、CDCA4およびCDCA7がE2F1を含むE2Fファミリーの新規標的遺伝子であることを解明した。さらに、E2F-responsive-elementのmutant作製、あるいはクロマチン免疫沈降法によるプロモーター配列とE2Fとの物理的な結合を証明した。
CDCA4およびCDCA7のcDNAをRT-PCRにより増幅し、FlagおよびGal4 DNA-binding domainとの融合タンパク発現ベクターを作製した。同時に、GFPを蛍光マーカーとしてそれぞれのcDNAとキメラタンパクを生ずるような発現ベクターを作製し、細胞局在を観察した。結果、CDCA4およびCDCA7は核にのみ局在し、mammalian one-hybrid assayから両タンパクが転写調節能を有する事実を解明した。また、CDCA4とGSTとの融合タンパク質を大腸菌で作製し、これを抗原としてポリクローナル抗体を作製した。得られた抗体を用いてタンパク-タンパク相互作用解析を今後続行する。
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Research Products
(6 results)
