誘導型高発現遺伝子プロモーターの調節機構の解明および機能開発

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17780074
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 橋本 義輝 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 講師 (00323254)
• Keywords: シュードモナス / ニトリル / 代謝 / 発現 / クローニング / 塩基配列 / 細菌

Research Abstract

ニトリル分解菌Pseudomonas chlororaphis B23(以下、B23株と略)は、Nitrile hydratase(NHase)により様々なニトリルをアミドに変換し、生じたアミドをさらにAmidaseにより酸とアンモニアに分解する。両酵素は、ニトリルを合成する酵素Aldoxime dehydratase、機能未知の2つのORF(ORF1、ORF2)、(ニトリルから生じた酸の代謝に関わる)アシルCoA合成酵素とともに遺伝子クラスターを構成している。本遺伝子クラスターのプロモーターは発見できていない為、本クラスターはさらに上流まで伸びていると考えられた。B23株の染色体DNAを各種制限酵素で切断した断片に対して、本クラスター最上流にあるAldoxime dehydratase遺伝子をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った。明瞭なシグナルが得られた制限酵素を選択し、シグナルの得られた大きさのDNA断片のライブラリーを構築した。Aldoxime dehydratase遺伝子の一部を増幅可能なプライマーを用いてコロニーPCRを行い、構築したライブラリーからさらに上流領域を含むプラスミドを選択し、上流領域のクローン化を行った。
上流部分の塩基配列を決定し、上流逆向きに新しいORFを見いだした。相同性検索の結果、本ORFは転写調節タンパク質と相同性を示すことから、アミドによるニトリル合成・分解酵素群の誘導発現調節に関与する転写調節タンパク質と示唆された。