2006 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
17790083
|
|---|
| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
小橋 信行 独立行政法人理化学研究所, 吉田化学遺伝学研究室, 協力研究員 (70334331)
|
|---|
| Keywords | TMX / 結晶構造解析 / thioredoxin |
|---|
| Research Abstract |
昨年度はTMXの大量生産・精製系の確立を行うことを目標に研究を行った。しかしながら大腸菌培養液1リットルあたり0.2mgと十分とはいいがたく、加えてTMXとの結合が知られている薬剤との結合が質量分析で確認できなかった。そこで今年度は結晶化に適した正しい構造をもつサンプルを得るために発現時にシャペロン系のタンパク質を共存させるなどを試みた。難発現性タンパク質の発現には大腸菌培養温度が顕著な影響を与えることが知られているので培養温度は一般的に適しているといわれる20度前後だけでなく、大腸菌の生育限界に近い12度やより高温の30度、37度を試してみたが発現量に顕著な改善は見られなかった。また、不溶画分には大量のTMXが得られていることから、リフォールディング条件の検討も行った。6M塩酸グアニジンや8M尿酸で不溶画分に含まれるTMXを可溶化したのち4度、20度それぞれで透析を行ったのちグルタチオンセファロースへの吸着を試験した。しかしながらリフォールディングに成功したことを示す顕著な吸着は確認できなかった。そこで根本的な解決を図るため、TMXの発現長を変更することを計画した。具体的にはこれまで発現に用いてきた領域はTMXのthioredoxinドメインのみであったが膜貫通領域直前まで発現系に組み込む。現在塩基配列の確認を含めて正しく組み込まれたプラスミドを選別する作業を行っている。作成が完了し次第新たなプラスミドを用いて発現条件の検討を行う予定である。
|
