BRETによる新規生理活性脂質受容体のリガンド同定

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17790180
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 岸 美紀子 群馬大学, 大学院・医学系研究科, 助手 (90396630)
• Keywords: シグナル伝達 / 脂質 / GPCR / BRET

Research Abstract

既知の生理活性脂質受容体とアミノ酸レベルで有意な相同性をもつオーファンGPCRのうち、脳をはじめ組織特異的に発現する受容体を約10個選択し、これらの受容体とルシフェラーゼとの融合タンパク質をコードするプラスミドを作成した。得られたプラスミドを動物培養細胞に遺伝子導入し、一過性に融合タンパク質を発現させた。ルシフェラーゼ活性測定により、これらの融合蛋白質が安定して高発現することを確認した。また、目的とする融合タンパク質のアミノ末端に付加したタグ配列に対する抗体をもちいてフローサイトメトリーを行い、融合タンパク質の細胞膜表面への発現を調べたところ、細胞内では発現しているが細胞膜表面への発現が低いものが数種あった。これらについても今後詳細に解析予定である。
また、GFP-アレスチンを安定的に発現する培養細胞株(CHO細胞由来)を樹立した。RT-PCR法を用いてアレスチンmRNAの発現を確認し、マイクロプレートアナライザを用いてGFPの発現量を確認した。低発現株、高発現株ともに今後の研究に使用する。
リガンド源については生体からの脂質抽出を行った。マウス脳からBligh&Dyer法を用いて総脂質を抽出した。今後この抽出脂質の粗分画を用いてBRETによるアッセイを行っていく。
学会に出席し国内、国外の研究者とBRETの実践的・技術的な側面について議論し、また助言を得られたことも研究の推進に役立っている。