2005 Fiscal Year Annual Research Report
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17790312
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| Research Institution | The Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
松田 剛 独立行政法人理化学研究所, 分子ウイルス学研究ユニット, 協力研究員 (60392130)
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| Keywords | 核小体 / 遺伝子導入 / タンパク質精製 / レポーターアッセイ |
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| Research Abstract |
1、NCp7の核小体局在ドメイン同定のために、NCp7のC末端にEGFPを融合した哺乳類細胞発現用ベクター(WT)のN末端からC末端側にむかって、N末端塩基性領域(N)、Zinc finger1 (Z1)、中央塩基性領域(C)、Zinc finger2 (Z2)を欠損した変異体(dN、dNZ1、dNZ1C、dNZ1CZ2)を作製した。各ベクターをHeLa細胞にtransfection後、局在を確認したところ、WTおよびdNだけが核小体に局在した。次にZ1、C、Z2各ドメインを欠損した変異体(dZ1、dC、dZ2)は、全て核小体に局在した。さらに、Z1およびZ2の両方を欠損した変異体(dZ1Z2)は、核小体へ局在した。そこで、Cの塩基性アミノ酸をpoint mutationによりAlaに置換した変異体(CA)、Nの塩基性アミノ酸4つをAlaに置換した変異体(N4)、N4に続きZ1の始めの塩基性アミノ酸Lysを酸性アミノ酸Gluに置換した変異体(N5)は、N4で核小体への局在が弱まり、N5で核小体への局在が消失した。一方、CAは核小体へ局在していた。以上のことから、NCp7の核小体局在ドメインはNからZ1にかけての塩基性領域であることが示唆された。
2、核小体への遺伝子導入用タンパク質作製のために、核移行能および細胞膜通過能のあるVprと核小体局在能のあるNCp7を融合したVpr-NCp7-EGFP/pGEX6P3発現プラスミドを作製した。大腸菌内でGST-Vpr-NCp7-EGFPとして発現させ、GSHカラムを用いてタンパク質の精製を行った。
3、核小体でのレポーターアッセイ用ルシフェラーゼ発現プラスミドを作製するために、IRESを組み込んだIRES/pGL4.10を作製した。LTR-IRES/pGL4.10および、逆向きLTRを挿入したRTL-IRES/pGL4.10を作製した。
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