塩基性線維芽細胞成長因子による網膜神経節細胞の分化制御-転写因子の関与-

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17791250
• Research Institution: Nara Medical University
• Principal Investigator: 杉岡 美保 奈良県立医科大学, 医学部, 助手 (90322370)
• Keywords: 神経網膜 / 細胞分化 / 細胞増殖 / 鶏胚 / チロシンキナーゼ型受容体 / カルシウム

Research Abstract

鶏胚網膜神経層において、G蛋白共役型受容体の活性化によるカルシウム動員、及び、容量性カルシウム流入が、発生過程上の細胞増殖期の神経上皮細胞、中でも細胞周期上のS期(DNA合成期)の細胞で顕著に生じ、分化した細胞(網膜神経節細胞)では痕跡的であること、これらストア作動性カルシウムシグナル系がDNA合成を制御することを既に報告している。今年度はまず、チロシンキナーゼ型受容体を活性化する塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)が、鶏胚網膜神経上皮細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を上昇させないことを明らかにした。次に、bFGFによる網膜神経上皮細胞の細胞増殖・細胞分化への影響を検討するため、準備段階としてその評価方法を確立した。細胞増殖効果の評価は、孵卵2.5日目から器官培養を開始した網膜神経層をパパイン処理にて単離し、血球計算板で全細胞数をカウントする、或いは、トリチウムチミジンを器官培養液中に添加してDNA合成中の細胞に取込ませたあと、シンチレーションカウンターでトリチウムのカウントを測定することで行えることを確認した。細胞分化効果、特に分化した各種網膜細胞の数・割合に対する効果の評価は、器官培養後の網膜神経層をパパイン処理にて単離し、網膜神経節細胞を認識する抗体(NR4)による免疫染色を行い、陽性細胞をカウントすることで行えることを確認した。他の網膜細胞を認識する抗体についても同様に検討中である。網膜神経層の組織構築・細胞形態に対する効果の評価は、器官培養後の網膜神経層から切片を作成し、一般染色(HE染色)することで行えることを確認した。さらに各種網膜細胞を認識する抗体を用いた免疫染色法についても同様に検討中である。また来年度に向けて、bFGF及びbFGF受容体の遺伝子発現の発生過程における変化を検討するために必要な、リアルタイムPCRシステムを購入し、そのセットアップを行った。