ゲノムマイニングに基づく異宿主発現による新規ラッソペプチドの生産

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17F17095
• Research Institution: Shizuoka University
• Principal Investigator: 小谷 真也 静岡大学, 農学部, 准教授 (20510621)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): JAIN RAKESHKUMAR 静岡大学, 農学部, 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2017-11-10 – 2020-03-31
• Keywords: ラッソペプチド / ゲノムマイニング / 異宿主生産

Outline of Annual Research Achievements

ラッソペプチドとは、その構造的特徴から命名された抗菌ペプチドのグループの名称である。現在までに数々のラッソペプチドがαプロテオバクテリア、大腸菌および放線菌から単離・構造決定されている。構造の特徴は、20-30残基のアミノ酸からなるペプチドにおいてN末端のアミノ基が、N末から9-10残基目に存在するアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖のカルボキシル基とペプチド結合を形成し、“輪”を形成する。さらにC末端の直鎖部分が輪の中を貫通するという特異な立体構造を有しており、その構造が“投げ輪”に似ているためラッソペプチドと呼ばれている。その生合成は非常にシンプルであり、大腸菌の代表的ラッソペプチドmicrocin J25の場合、構造遺伝子mcjA、修飾酵素mcjBおよびC、トランスポーターmcjDとわずか4つの遺伝子で生産されることが明らかとなっており、ゲノム情報から生合成遺伝子の予測が容易である。ゲノムマイニングを行い、バクテリアから新規ラッソペプチドの探索を行い、候補となる菌を選抜した。その結果、Luteimonas abyssi DSM25880株のゲノム情報に、新規ラッソペプチドの生合成遺伝子クラスターを見出した。そこで、プライマーDNAを合成し、遺伝子クラスターの全長をPCR法で増幅した。増幅した断片は、制限酵素で消化し、発現用プラスミドに組み込んだ。エレクトロポレーションを行い、生産菌に遺伝子導入することに成功した。現在、異宿主生産を行うための培養実験をおこなっている。さらに培地の検討を行い、ラッソペプチド高生産の培養条件の検討を行う。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り生合成遺伝子の増幅を行い、発現用ベクターへの組み込みが順調に行えた。さらにエレクトロポレーションによる遺伝子導入も当初効率が低く、現在高効率で行える条件を検討中であるため、研究が推進している。

Strategy for Future Research Activity

新規ラッソペプチドの生産量の検討を行っており、培養条件のちょっとした違いによって、生産量が大きく変動することが確認できている。今後は、培地成分、培養温度、振とう速度など、培養条件を検討することで、大量のラッソペプチドの生産を行う予定である。ラッソペプチドが得られた時点で、NMRおよびESI-MSによる構造解析、活性試験等を行い、ラッソペプチドの物性を明らかにする予定である。