Improvement of freezing tolerance of wheat by development of new strategy for transgene-free genome editing

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17F17747
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 今井 亮三 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主席研究員 (90291913)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): MLADENOV PETKO 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門 遺伝子利用基盤研究領域, 外国人特別研究員
• Project Period (FY): 2017-11-10 – 2020-03-31
• Keywords: 低温馴化 / コムギ / 耐凍性 / 越冬性 / フルクタン

Outline of Annual Research Achievements

本研究では，フルクタン高蓄積型コムギをゲノム編集技術を利用して作出すること目的にしている．フルクタンの分解に働くfructan endohydrolase（FEH; EC. 3.2.1.153）のうち、低温馴化時に誘導されるwfh-sm3 遺伝子及び構成的に発現するFEH1遺伝子のゲノム情報を基に、各ゲノム共通に遺伝子変異を導入可能なガイドRNAをそれぞれ6種類と1種類デザインした．合成したgRNAの適性を評価するため，各gRNAを大腸菌より精製したCas9タンパク質と混合し，ターゲット配列を含むゲノムDNA断片に対して作用させた．その結果，wfh-sm3 遺伝子については4種類のCRISPR/Cas9がターゲット配列をin vitroで切断できることが示された．一方FEH1については，デザインした1種類のCRISPR/Cas9がターゲットｃDNAを切断することが示された．CRISPR/Cas9 RNPを金粒子に吸着させ，パーティクルガンを用いて茎頂メリステムに導入し，5葉ステージまで生育させた．第5葉DNAを用いたCAPS解析ではwfh-sm3遺伝子については複数の非切断個体が得られている．これらのゲノム配列については、今後決定する予定である．また，FEH1遺伝子については、順次ボンバードを行った後に生育させた個体が得られているので，今後は5葉の出現を待ってCAPS解析による変異同定していく予定である．

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

種子に混入するカビの発生を抑えるのが難しく，これまで十分量の茎頂を育てることができなかったが．抗菌剤PPTを吸水時に使用することでカビの繁殖を効果的に抑えることが可能になった．現在，変異の候補個体が得られてきているので，継続した解析によりゲノム編集個体変異導入実験については順調に動き出したカビのwfh-sm3の変異創出にはgRNAを再デザインすることで対応可能と推定される．

Strategy for Future Research Activity

継続した解析によりゲノム編集個体の獲得が可能になると考えられる．6倍体ゲノムの全遺伝子変異体を得ることができれば，種子を増幅し，フルクタン蓄積量や，越冬性について評価を行う．