2017 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of regulatory mechanism of cardiac mechanics by molecular-spring connectin and clinical application for heart failure
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17H00859
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
毛利 聡 川崎医科大学, 医学部, 教授 (00294413)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
塚田 孝祐 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 准教授 (00351883)
花島 章 川崎医科大学, 医学部, 助教 (70572981)
橋本 謙 川崎医科大学, 医学部, 講師 (80341080)
氏原 嘉洋 川崎医科大学, 医学部, 助教 (80610021)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 心臓メカニクス / コネクチン（タイチン） / 拡張障害性心不全 / 心機能 / 冠循環 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心臓は収縮と拡張を繰り返す血液ポンプであり、様々な疾患によって引き起こされる収縮障害性の心不全に関して多くの治療法が開発されてきた。一方、拡張障害性心不全の臨床的重要性が近年になり認識されてきたが、その病態生理は不明な点も多く、治療法も限られている。本研究は心機能評価フレームワーク：可変弾性モデルによる心臓レベルでの機能評価を基盤とし、生体医工学的な手法を駆使した細胞レベルの機械特性の評価、更に分子レベルでの制御メカニズムを検討して心不全の病態解明へと繋げる事を目的としている。具体的な標的分子は心臓の拡張性を規定する巨大バネ分子：コネクチン（別名タイチン、3万アミノ酸）であるが、生体内最大の大きさに起因する技術的制限から過去には数百アミノ酸生成による局所の機能解析が報告されているのみである。このような現状に対し、2万塩基対以上（約7000アミノ酸）の導入が可能なバキュロウイルスを用いた遺伝子導入法を用いてコネクチン分子内でバネとしての機能を果たしているI帯領域（アクチン・ミオシン非重複部で、弾性領域を含む）を発現させ、光ピンセットによる分子丸ごとの力学的機能評価法の確立に取り組みたいと考えている。これらの研究により、コネクチンの各領域が有する力学特性を明らかにし、病態モデルマウスを用いてコネクチンのアミノ酸配列変化や、メカノトランスダクションによる分子・細胞レベルでの応答を解明する。また、過度の拡張性は心臓への血液供給（冠循環）を障害するため、心臓拡張性と冠循環についても検討してコネクチンが心臓メカニクスを制御する機構を分子・細胞・臓器レベルで解明する。コネクチンは拡張型心筋症の重要な原因遺伝子としても注目されており、本研究ではその多彩な機能を明らかにすることにより心不全の病態生理解明・新規治療法開発に貢献したいと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
コネクチン分子の機械特性計測について光ピンセットによる計測系を立ち上げ研究を進めている。計測分子に関しては、コネクチンのアイソフォームであるNovex3（分子量62.5万）のクローニングに成功し、N末端にGSTタグ、C末端にビオチン化BDTCタグを持つポリペプチドとして大腸菌内で発現させて精製した。GST抗体、アビジンをコーティングしたビーズに接着して検体を作成した。現在はこの検体を用いて光ピンセットによる計測の最適条件を検討している。クローニング出来たNovex3はBacmid化して昆虫細胞内で増殖させたバキュロウイルスをマウス単離心筋細胞に感染させ、過剰発現させることに成功した。コネクチン分子PEVK領域はバネとしての弾性を発揮する以外に、細胞内での力学的情報伝達（メカノトランスダクション）を担う分子としても注目されており、心筋細胞に発現するN2BAアイソフォームのPEVK領域に結合するタンパク質を酵母２-ハイブリッド法にて網羅的にスクリーニングして２種類の候補分子を同定した。また、これらのコネクチン分子の生化学的・力学的特性の解析と並行して、レーザーによるリン光系有機色素の光化学反応を利用した生体の酸素濃度計測技術を用いて心臓の局所酸素分圧評価法の確立に取り組んでおり、Nd:YAGレーザーによる励起によるリン光の減衰を計測・解析するシステムを立ち上げておりin vivo実験系にて微小循環の酸素計測を可能にする。
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| Strategy for Future Research Activity |
横紋筋細胞のバネ分子コネクチンはそのサイズの大きさから解析が困難であり、これまでも分子局所の研究のみが報告されて来た。昨年度のバキュロウイルスを用いた試行で分子量62.5万のNovex3のクローニングおよび心筋細胞への強発現に成功したため、コネクチンI帯領域全長（分子量300万）をクローニングし、昆虫細胞細胞内で増殖させたバキュロウイルスをマウス単離心筋細胞に感染させ、コネクチンI帯領域全長を導入し過剰に発現させる。発現させたコネクチンI帯領域全長が生体内と同様にN末端側をZ線、C末端側がミオシンフィラメント末端に局在していることを確認し、独自の細胞引張装置にて伸展性を細胞レベルにて評価するシステムの構築を目指す。また、光ピンセットについては、コネクチン分子機械特性計測に最適なビーズの選択、実験溶液の試行を継続する。上述の分子・細胞レベルでの機能制御・評価法の開発に加え、心室レベルでの形態と伸展性の関連について検討を行う。具体的には、冠循環の無い心臓（カエルなど）のスポンジ状心室は冠循環心臓に比べて非常に高い伸展性を示すことを明らかにしてきたが、スポンジ状の心室組織は折り畳まれたメッシュ構造によって心筋細胞自身が伸展されなくても心室の伸展を可能にする仕組みがあることなどが予想される。この心室微細構造を固定することなしに評価する為に、軽元素からなる軟部組織を描出出来る大型放射光施設：SPring-8の位相差CTにて実験を行う予定である。
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[Presentation] 伸びることを拒んできた私達哺乳類の心臓：心室拡張機能の進化的考察2017
Author(s)
本田 威, 田村 太志, 花島 章, 氏原 嘉洋, 山澤 隆彦, 古川 博史, 橋本 謙, 渡部 芳子, 柚木 靖弘, 田淵 篤, 種本 和雄, 毛利 聡
Organizer
第110回日本循環器学会中国・四国合同地方会
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