2017 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of mechanisms and expansion of application range of sonoporation by in situ observation of bubble-cell interaction
| Project/Area Number |
17H00864
|
|---|
| Research Institution | Hokkaido University |
|---|
Principal Investigator |
工藤 信樹 北海道大学, 情報科学研究科, 准教授 (30271638)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松崎 典弥 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (00419467)
鈴木 亮 帝京大学, 薬学部, 准教授 (90384784)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | ソノポレーション / 超音波治療 / 高速度顕微観察 / ファインバブル / 細胞培養 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
【観察システムの開発（工藤）】
○既存の高速度観察システム（顕微鏡１）に新規購入した高速度カメラを接続し，気泡と細胞の相互作用を観察する基礎実験を通じて，長時間観察の有用性，細胞観察における高ダイナミックレンジ画像取得の優位性を確認した．○既存の顕微観察システム（顕微鏡２：落射蛍光顕微鏡）に新規導入した共焦点顕微ユニットを追加し，ソノポレーション現象の共焦点観察を行った．○顕微鏡２での側方観察手技を検討し，基本的に顕微鏡１で用いていた手技が利用可能であることを確認した．○顕微鏡１と顕微鏡２の照明光学系を比較し，高速度撮影用の照明光学系の設計を行った．
【In vivoモデルの開発】
○In vivo模擬条件として柔軟なゲルを用い，超音波を受けた気泡とゲルの相互作用を種々の照射条件下で高速度観察した（顕微鏡１）．その結果，気泡が大きく膨張する際にゲルを変形させ，その復元力が気泡をゲルから離れる方向に移動させていることを明らかにした（工藤）．◯培養細胞を用いた毛細血管網モデルの開発：阪大が有する３次元培養技術と，北大でのこれまでのソノポレーション研究成果を確認する報告会を開催した．３次元培養開始のための準備として，北大側でヒト血管内皮細胞の培養手技の習得を行った（工藤，松崎）．◯樹状細胞モデルの開発（鈴木）：樹状細胞（DC2.4）を培養し，気泡を付着・貪食した細胞を作る手技を開発した．予備的な検討として気泡を付加した樹状細胞のソノポレーション現象を共焦点顕微観察し（顕微鏡２），蛍光観察法について検討した．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度，研究計画の第１ステップとして，新規に購入した装置，高速度カメラと共焦点観察ユニットのソノポレーション研究における有用性を明らかにする検討を行った．各装置の検討には，従来設備である２台の顕微鏡を用いた．続く第２ステップでは，これら２台の顕微鏡で別々に行ってきた高速度撮影と共焦点観察を，１台の顕微鏡にまとめるための作業として側方観察チャンバの作製を行い，さらに高速度撮影のための照明光学系を検討した．当初の予定では，直接第２ステップを実施する予定であったため，第１ステップを経た分，観察システムの開発スケジュールに多少の遅れを生じた．しかし，新高速度カメラによる側方観察を優先したことにより，周囲環境が気泡のダイナミクスに与える影響と気泡と細胞の相互作用の検討に関する重要な知見を早期に得ることができた．本結果は，世界的に注目を受け．6回の招待講演（国外5回，国内1回）で成果を報告することができた．
また，in vivoモデルの開発について，ゲルモデル，樹状細胞モデルに関する検討を進めた．種々の超音波照射条件下でゲルモデル近傍での微小気泡のダイナミクスを観察し，周囲環境が気泡の運動に影響を与える機序を検討した．また，樹状細胞については，気泡を貪食した細胞のソノポレーション現象の観察に向けて基本的手技を検討した．これらの点については順調に進んでいる．３次元培養技術については当初予定よりも時間を要しているが，技術的ハードルの高い課題であるため時間をかけて取り組むこととし，その間はゲルモデルで検討を進める判断をした．
|
| Strategy for Future Research Activity |
【ソノポレーション現象の観察】(工藤)
○観察システムの完成：共焦点観察可能な顕微鏡（顕微鏡２）に高速度カメラおよび強力照明光源を接続し，共焦点観察，落射蛍光観察，光ピンセット機能の全てを実現できる顕微鏡観察システム完成する（継続）．◯側方観察光学系の改良：昨年度検討した側方観照明光学系の調整を，短時間に確実に実現する光学系を新規に試作する．また，観察サンプルの作製が容易になるよう，側方観察用チャンバの構造を改良する．In vivoを模擬してゲル上に培養した細胞のソノポレーション現象を新システム，観察チャンバを用いて観察し，高音圧短パルスと低音圧長パルス照射下でのソノポレーション現象の違いを明らかにする.
【In vivoモデルの開発】
◯ゲルを用いた毛細血管網モデルの開発（工藤）：高速度観察による毛細血管・小リンパ管内における気泡のダイナミクスの解明には，多数回の実験を繰り返す必要があるが，3次元培養技術を用いた毛細血管網モデルの作製は技術的に困難で多数作成することが難しい．そこで，より簡単に作成できるモデルとしてゲルを用いた管腔モデルを開発する．ゲルで作製したモデルを用いて微細管腔内の微小気泡のダイナミクスを明らかにする．また，松崎と協力して管腔モデル内腔への細胞培養を実現し，気泡と細胞の相互作用を観察する.◯培養細胞を用いた毛細血管網モデルの開発（松崎）：松崎が有する3次元培養技術を用いた毛細血管網モデル作製技術とその蛍光観察の手技を北大に技術移転する（継続）．◯樹状細胞モデルの開発（鈴木・工藤）：樹状細胞（DC2.4）を用い，未熟な樹状細胞（異物貪食能が高く足場に付着しやすい）と成熟した樹状細胞（貪食能が低く液体中に浮遊しやすい）に対してソノポレーションを行い，効果の違いを明らかにする．
|
