2017 Fiscal Year Annual Research Report
Novel membrane proteins by combining computational design and in vitro directed eovlution
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17H00888
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松浦 友亮 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (50362653)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大崎 寿久 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所, 人工細胞膜システムグループ, 研究員 (50533650)
藤井 聡志 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所, 人工細胞膜システムグループ, 研究員 (60619005)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 無細胞翻訳系 / 膜タンパク質 / リポソーム / 合理的設計 / 進化分子工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、機能性人工膜タンパク質を計算機による合理的デザインと進化分子工学を組み合わせて創り出すことを目指す。機能を持つ人工膜タンパク質の創生が可能となれば、膜タンパク質の設計原理が明らかになるだけでなく、医療や産業界で様々な分野で利用可能な人工分子を創り出せる可能性がある。
米国の研究協力者らは近年、安定なヘリックスバンドル構造を自在にデザインできる理論を開発した（Huang et al., Science, 2014）。彼らは、この論理を拡張し脂質二重膜に組み込まれるようにヘリックスバンドル構造をデザインしなおした。これらの人工膜タンパク質はサイズの異なるポアを持つようにデザインされている。
我々は、人工膜タンパク質の一つである7h2Lの機能を我々の独自技術であるリポソームディスプレイ法を用いて計測し、ポアの存在を確認した。しかし、いずれの人工膜タンパク質も膜挿入効率が天然配列と比較して1/30程度以下しかなかった。また、研究分担者らの結果から、人工膜タンパク質が４次構造にヘテロ性を有している（単分散構造をとっていない）ことが示唆された。これらの結果は、人工膜タンパク質の機能（膜挿入活性・ポア形成活性）が天然配列と比べて著しく劣ることを意味する。生細胞では正電荷を有するアミノ酸の位置が膜タンパク質のトポロジーや膜挿入効率を規定する一つの要素であることが知られている（von Heijne, G., Nat Rev Mol Cell Biol, 2006）。そこで7h2L配列の膜外領域に正電荷を配置した変異体を複数デザインし、膜挿入活性の高い分子を創り出すことを目指した。その結果、正電荷のアミノ酸の配置によって、膜挿入効率が著しく異なる事を明らかにした。7h2Lよりもポア形成能が３倍ほど高い変異体の取得に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
人工膜タンパク質の一つである7h2Lの高機能化に取り組んだ。7h2Lは、1 nmのポアを持つようにデザインされている、。生細胞では正電荷を有するアミノ酸の位置が膜タンパク質のトポロジーや膜挿入効率を規定する一つの要素であることが知られている（Positive inside rule）。そこで平成２９年度は7h2L配列の膜外領域に正電荷を配置した変異体を複数デザインし、膜挿入活性の高い分子を創り出すことを目指した。その結果、予想通り正電荷のアミノ酸の配置によって、膜挿入効率が著しく異なる事を明らかにした。現在、7h2L以外の人工膜タンパク質の機能解析も同時に進めており、研究は順調に進んでいると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、7h2Lの変異体を出発配列として、リポソームディスプレイ法によりポア形成活性を向上させる。そのためには、ある特定のサイズのポアを有する人工膜タンパク質をスクリーニングする技術が必要である。そこで、今後、リポソームディスプレイ法を用いて特定のポアサイズを有する分子の選択が可能であることを示す。具体的には、デザインされているポアサイズよりも小さい分子は通すが大きい分子は通さないスクリーニング系を構築する。例えば、7h2Lの場合には、緑色蛍光物質であるAlexaFluor488-biotin（<1 nm）と赤色蛍光物質であるAlexaFluor546-AAA-biotin（>>1 nm）の２種類を用いる（AAAはアデノシン3塩基のオリゴDNA）。7h2Lをリポソーム内で合成し、２種類の蛍光物質を加える。緑色蛍光は持つが赤色蛍光は持たないリポソームをセルソーターで分取する。この実験が実施可能であることを確認するために、7h2LとΔ7h2L（不活性型の7h2L）の遺伝子を混合し、7h2L遺伝子を濃縮できる条件を明らかにする。
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Research Products
(6 results)
