2018 Fiscal Year Annual Research Report
Novel membrane proteins by combining computational design and in vitro directed eovlution
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17H00888
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
松浦 友亮 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (50362653)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大崎 寿久 地方独立行政法人神奈川県立産業技術総合研究所, 人工細胞膜システムグループ, サブリーダー (50533650)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 進化分子工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、機能性人工膜タンパク質を計算機による合理的デザインと進化分子工学を組み合わせて創り出すことを目指す。機能を持つ人工膜タンパク質の創生が可能となれば、膜タンパク質の設計原理が明らかになるだけでなく、医療や産業界で様々な分野で利用可能な人工分子を創り出せる可能性がある。
米国の研究協力者らは近年、安定なヘリックスバンドル構造を自在にデザインできる理論を開発した（Huang et al., Science, 2014）。彼らは、この論理を拡張し脂質二重膜に組み込まれるようにヘリックスバンドル構造をデザインしなおした。これらの人工膜タンパク質はサイズの異なるポアを持つようにデザインされている。
我々は、現在までに、人工膜タンパク質の一つである7h2Lの機能を我々の独自技術であるリポソームディスプレイ法を用いて計測し、ポアの存在を確認した。本タンパク質は7量体を形成するようにデザインされている。リポソームディスプレイ法とは、細胞サイズの人工脂質二重膜小胞内にセルフリータンパク質合成系を封入し、内部で膜タンパク質を合成する方法である。本年度は、7h2Lとその変異体であるC7_s2にランダム変異を導入した遺伝子ライブラリーを作製し、これらタンパク質の機能進化を目指した。
本年度は、これに加えてC6、C8と名付けられたそれぞれ6量体、8量体を形成する人工膜タンパク質の機能解析を行った。C6、C8ともにその4次構造、結晶構造が研究協力者によって明らかにされている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度に引き続き、本年度も人工膜タンパク質の一つである7h2Lの高機能化に取り組んだ。7h2Lは、10オングストロームのポアを持つようにデザインされている。一方で、その機能は、天然のポア形成タンパク質（αヘモリシン）と比べると著しく低いことがわかっている。7h2Lにランダム変異を導入したライブラリーを用いリポソームディスプレイ法により機能進化をはかったが、機能の向上が見られる変異体は得られなかった。ここで言う機能とは、リポソーム外部に加えたAlexaFluor488-biotinの拡散によるリポソーム内への流入である。遺伝子濃度を調整するなどにより、選択圧を弱めるなど、様々な工夫をして見たが、結果的に機能進化は観測されなかった。
そこでC7_s2という7h2Lにpositive inside ruleを元にデザインして変異を導入したクローンを作製したところ、7h2Lよりも3倍程度機能向上が見られた。C7_s2にランダム変異を導入したライブラリーを作製し、リポソームディスプレイ法による進化実験に取り組んでいるところである。
平行して、これに加えてC6、C8と名付けられたそれぞれ6量体、8量体を形成する人工膜タンパク質の機能解析を行った。具体的には、緑色蛍光物質であるAlexaFluor488-biotin（<10オングストローム）とAlexaFluor488-A11-biotin（>>10オングストローム）の２種類の蛍光物質を用い、リポソーム膜上にC6とC8で形成されるポアを透過するのかを調べることによって、ポア大きさがデザイン通りであることを確認した。加えて、C6、C8をリポソーム存在下でセルフリータンパク質合成系を用いて合成し、これらの膜挿入効率を定量的に測定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、C7_s2にランダム変異を導入したライブラリーを作製し、リポソームディスプレイ法による進化実験に取り組んでいる。変異率を２－３アミノ酸/クローンに設定して実験を進めているが、機能進化が見られない場合、変異率を変更したライブラリーを複数作製して、進化実験を行うことも見当する。DNAシャッフリングやその類似法を組み合わせてゆくことも検討する。
C7_s2を含めた変異体の4次構造情報を得るための実験系の構築を行う。具体的には、セルフリータンパク質合成系で合成し、これにHistidine-tagを蛍光修飾する化合物を加え、ゲルろ過クロマトグラフィーで分析する。C7_s2を含めた全ての人工膜タンパク質にはHistidine-tagがあるので、この手法はC6、C8を含めた人工タンパク質の解析にも利用可能である。ゲルろ過クロマトグラフィーは、初年度に購入したShimadzuのHPLC装置で行う。これにより、セルフリータンパク質合成系で合成した膜タンパク質が特定の4次構造を取っているのかを明らかにできる。
C6、C8については、リポソーム存在下でセルフリータンパク質合成系を用いて合成し、これらの膜挿入効率を定量的に測定した。今後、更に詳細を明らかにするために、分担者の大崎にサンプルを提供し、ポア形成能力を定量的に測定してゆく。また、代表者のグループでも膜挿入量だけでなく、膜貫通しているタンパク質の量を定量する技術を確立してゆく。
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