2017 Fiscal Year Annual Research Report
Study of recognition mechanism on glycan-biosynthesis in the Golgi by means of chemically synthesized homogeneous glycoproteins
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17H01214
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
梶原 康宏 大阪大学, 理学研究科, 教授 (50275020)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐藤 あやの 岡山大学, 自然科学研究科, 准教授 (40303002)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 糖タンパク質 / 糖鎖 / ゴルジ体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
鶏卵から糖鎖-アスパラギンを調製し、このアスパラギンの両端にペプチドを水溶液中で連結する新規糖ペプチド合成法を検討した。この反応では、native chemical ligation (NCL)というペプチドを連結するための補助基としてSeitzらが報告したチオール基を持つN-ベンジル系化合物をヒト型糖鎖に導入した。そして、糖鎖アスパラギンのN末端側、C末端側にこの補助基を導入することで、ペプチドが実用的に連結できることができた。この方法を用いて、現在、糖鎖末端がdi-GlcANcになった２分枝複合型糖鎖をもつエリスロポエチン(EPO)等の合成をおこなっている。
糖鎖末端が、di-GlcANcのN型糖鎖をもつ小型糖タンパク質CCL-1の合成をおこない、超遠心で単離したゴルジ装置の破砕溶液に加え、どのような糖鎖付加が進行するか考察した。その結果、疎水性の高い糖鎖アスパラギン誘導体や糖タンパク質CCL-1に、N型糖鎖を３分枝にするGlcNAcが導入されることが確認できた。また、同様にエリスロポエチンの126番目にO－GalNAcが導入される際、どのようなアミノ酸配列が認識されているかその周辺のペプチドを様々合成し、ゴルジ画分に入れLCMSを用いて追跡した。その結果、126, 127, 128, 129位周辺の配列、特にプロリンの存在が必要であることがわかった。
ほ乳類の細胞にAlexa-Fluor標識されたコレラ毒素B（市販品）を加え、ゴルジ体、小胞体、そしてゴルジ体へ移動できるかその条件検討をおこなった。その結果、蛍光顕微鏡で追跡する限りAlexa-Fluor－コレラ毒素Bはゴルジ体、小胞体へ移動していることが確認できた。今後、di-GlcANc-N型糖鎖が結合したAlexa-Fluor－コレラ毒素Bをゴルジ体に導入し、その糖鎖構造変化がどのようになるか追跡する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
小型糖タンパク質を従来法で化学合成し、ゴルジ体画分に加えることで糖鎖の伸長をLCMSで追跡できたことから当初の予定通りのシステムが構築できたと考えている。また、新規な糖ペプチド合成法についても期待通り補助基を使うことで糖鎖アスパラギンとペプチドを連結できることが確認できた。また、生細胞をつかった糖タンパク質の導入法も確立できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、より中型の糖鎖タンパク質を合成し、本年度と同様ゴルジ画分と反応させ、タンパク質の物理化学的性質に依存して糖鎖分枝様式がかわるかを追跡する。また、糖タンパク質を利用するアフィニティーカラム等も検討し、ゴルジ体内の糖鎖分枝様式を制御している因子がなにか探索する。
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