2018 Fiscal Year Annual Research Report
細菌固定化蛋白質の水中接着能を利用する固体表面のワンポット自在修飾技術の創出
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17H01345
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
堀 克敏 名古屋大学, 工学研究科, 教授 (50302956)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加藤 竜司 名古屋大学, 創薬科学研究科, 准教授 (50377884)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | タンパク質 / 接着 / 生体材料 / 分子固定 / 原子間力顕微鏡 / 分子動力学シミュレーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高付着性細菌から発見されたナノファイバータンパク質AtaAは、様々な材料表面に対し驚異的な接着力を示す。本研究では、接着機能ドメインであることが示唆されているNheadに機能性ペプチドやタンパク質を融合し、化学修飾をしていない材料基盤に水中接触させるだけで固定し、産業、再生医療分野等で待望の機能性表面を創造することを目的とする。同時に、Nhead－ペプチド/タンパク質融合体と表面との結合状態（分子数・向き・積層状態・変形状態・融合機能分子－表面相互作用）を解明するとともに、それらを自在に制御する手法を世界で初めて創出する。今年度は、分子動力学シミュレーションとNhead/Nhead複合体の接着状態の計測、機能表面の創出を実施した。
１．Nheadの接着状態のシミュレーション：Nheadの接着状態を全原子分子動力学（MD）計算に基づいた熱力学積分法によってシミュレーションするため、まず、回転半径、絡み合い点間分子量、密度等の高分子基本物性を再現できるポリスチレンモデルを構築し、基盤材料の構造を得た。これに水分子中で平衡化したNheadの結晶構造と電解質水溶液を付加し、全原子系を構成した。
２．Nhead/Nhead複合体の接着状態の計測：Nhead、さらには機能性分子を融合した複合体の接着配向をAFMにより水中イメージングした。その結果、Nheadの濃度が低く表面を覆いつくさない条件では横向きに接着している様子が観察された。表面をNheadが覆いつくすほど高密度で接着させた条件では、判断が難しいことも明らかになった。
３．機能表面の創出：Nhead固定化表面が動物細胞の接着や増殖に与える影響を調べた。Nheadを固定化する基盤の元々の特性や動物細胞の種類によって、接着や増殖に与える影響が異なることが明らかになった。また、培地に含まれる成分がその原因のひとつであることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
分子動力学シミュレーションにおいては、ポリスチレン基盤の構造モデルを独自に得ることができ、Nheadの接着状態のシミュレーションの準備が整ったため。またAFMによるイメージングでは、接着状態のNhead複合体を水中で観察することに初めて成功したため。機能表面では、ペプチドを融合したNheadの機能を評価するには至らなかったが、その過程でストレプトアビジンがNheadに結合するという、機能表面を創出するにあたり重要な発見があったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．Nheadの接着状態のシミュレーション：今年度は、付着表面としてのポリスチレンの基盤構造を得た。また、Nheadの水中での挙動も計算できた。そこで、次年度はNheadが基盤に近づく時の相互作用について計算する。様々なRでのMD計算を実行して基盤と蛋白質の間に働く力の平均値<F(R)>を求め、この平均力の積分から自由エネルギープロフィールΔG(R)を得る。
２．ネイティブNheadの翻訳後修飾の構造決定と機能解明：今年度末、オリジナルのホスト微生物中では、AtaAのNheadが翻訳後修飾を受けているという、まったく予想外の事実が明らかになった。この構造と機能を明らかにしない限りは、Nhaedの付着機構を解明することはできないため、優先的に解析する。
３．Nhead/Nhead複合体の接着状態の計測と制御：各種材料表面に対するNhead/Nhead複合体の親和性、積層状態、接着に伴う変性の有無等をQCM-Dにより調べる。比較としてCheadや他のTAAのYlheadについても解析する。
４．機能表面の創出：今年度、Nheadとストレプトアビジン（SA）が直接相互作用するという予想外の重大発見をした。そこで次年度はNheadと相互作用し得る単量体SAの設計を行う。これができたら、Nheadとの複合体の結晶構造解析に挑戦する。
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[Journal Article] The Acinetobacter trimeric autotransporter adhesin Ata controls key virulence traits of Acinetobacter baumannii2019
Author(s)
M. Weidensdorfer, M. Ishikawa, K. Hori, D. Linke, B. Djahanschiri, R. Iruegas, I. Ebersberger, S. Riedel-Christ, G. Enders , L. Leukert , P. Kraiczy, F. Rothweiler, J. Cinatl, J. Berger, K. Hipp, V. A. J. Kempf, and S. Gottig
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Journal Title
Virulence
Volume: 10
Pages: 68-81
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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