2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of in vivo gene manipulation methods using CRISPR/Cas9 system
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17H01394
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
伊川 正人 大阪大学, 微生物病研究所, 教授 (20304066)
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2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 実験動物 / ゲノム編集 / ウイルスベクター / CRISPR/cas9 / ES細胞 / 不妊 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、オンデマンドゲノム編集システムの開発と、その応用である生殖不全マウスの重点解析を2つの大きな柱にして研究を進めている。さらにサブテーマを設けて目標を明確にし、連携研究者を担当者に配置することで、問題点の早期発見・解決および効率的に研究を推進している。
平成31年度もCRISPR/Cas9 システムゲノム編集システムの改良を進めた。前年度までに、標的20塩基直下のPAM配列として (NGG) ではなく、(NGN) を認識するNGN型Cas9を用いる場合、受精卵ゲノム編集は難しいものの、ES細胞では比較的効率的にゲノム編集できること示していた。平成31年度は、NGN型Cas9が優位性を発揮できる部分として、タンパク質のN末端やC末端へのタグ挿入を想定し、翻訳開始コドンATG、終止コドン (TAG/TGA) を標的としたゲノム編集への応用を試みた。残念ながら、近傍のNGGを標的に野生型Cas9を用いたゲノム編集効率の方が高いことが判明した。
一方で、ゲノム編集効率の悪い長領域欠損をES細胞と組み合わせてノックアウトマウスを作製することにより、ファミリー遺伝子をまとめて生理機能解析することに成功した。その結果、Pateファミリー、Cstファミリー遺伝子群が、精子ADAM3の成熟と雄の妊孕性に必須であることを見出し、論文報告した。それ以外に、精巣特異的に発現する30遺伝子が単独で欠損しても雄の妊孕性に影響ないものの、Drc7やKif9, Mtl5, Lypd4, Pate4, Tcp11が雄の妊孕性に重要なことを明らかにし、それぞれ論文発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NGN型Cas9の汎用性は低いものの、標的によっては十分に活性を示すことが分かった。また遺伝子破壊マウスを効率的に作製することで、雄性不妊となる遺伝子群を、多数論文報告した。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、ゲノム編集技術の開発とその応用による生殖関連遺伝子機能解析を行う。特にNGN型Cas9については、spCas9に加えてsaCas9についても改良を加えて検討を続け、全ての配列に対応するゲノム編集システムの構築を目指す。なお、汎用性を高めるために、受精卵EPによるゲノム編集動物作製の効率化にも取り組む。欠損すると雄性不妊となる遺伝子群から、精子形成や精子機能獲得メカニズムを明らかにする。
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[Journal Article] Male mice, caged in the International Space Station for 35 days, sire healthy offspring2019
Author(s)
Takafumi Matsumura, Taichi Noda, Masafumi Muratani, Risa Okada, Mutsumi Yamane, Ayako Isotani, Takashi Kudo, Satoru Takahashi, Masahito Ikawa
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 9
Pages: 13733
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Identification of multiple male reproductive tract-specific proteins that regulate sperm migration through the oviduct in mice2019
Author(s)
Fujihara Y, Noda T, Kobayashi K, Oji A, Kobayashi S, Matsumura T, Larasati T, Oura S, Kojima-Kita K, Yu Z, Matzuk MM, Ikawa M.
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Journal Title
Proc Natl Acad Sci U S A
Volume: 116
Pages: 18498-18506
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] CRISPR/Cas9-mediated genome editing reveals 30 testis-enriched genes dispensable for male fertility in mice2019
Author(s)
Lu Y, Oura S, Matsumura T, Oji A, Sakurai N, Fujihara Y, Shimada K, Miyata H, Tobita T, Noda T, Castaneda JM, Kiyozumi D, Zhang Q, Larasati T, Young SAM, Kodani M, Huddleston CA, Robertson MJ, Coarfa C, Isotani A, Aitken RJ, Okabe M, Matzuk MM, Garcia TX, Ikawa M.
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Journal Title
Biol Reprod
Volume: 101
Pages: 501-511
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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