2018 Fiscal Year Annual Research Report
Reconstitution of common marmoset oogenesis from pluripotent stem cells
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17H01395
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
林 克彦 九州大学, 医学研究院, 教授 (20287486)
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2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 始原生殖細胞 / 生殖巣体細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
始原生殖細胞特異的に蛍光タンパク質を発現するレポーター遺伝子（Blimp1^tdTomato (BT), Nanos3-EGFP (NG)）をもつコモンマーモセットES細胞から始原生殖細胞を誘導する条件を検討した。誘導は始原生殖細胞の分化に必須な転写因子を強制発現する方法と成長因子を与える方法をそれぞれ試した。その結果、転写因子の強制発現ではBTNG陽性細胞が認めらた。また成長因子による誘導においても、低い効率であるが、BTNG陽性細胞が認められた。転写因子の強制発現により誘導されたBTNG陽性細胞をマウスの生殖巣の細胞と凝集培養したところ、生殖細胞としての分化の促進が認められた。
一方、コモンマーモセットES細胞から生殖巣体細胞を誘導する研究において、マウスを使った先行研究を展開した。その結果、生殖巣体細胞までの分化過程において指標となる重要なレポーター遺伝子を複数決定した。コモンマーモセットにおけるこれらの遺伝子を同定し、その遺伝子領域にレポーター遺伝子を組み込むためのコンストラクトを構築した。
胎児または新生児卵巣の培養方法を確立する研究において、新生児卵巣の入手経路を確立した。その後、得られたコモンマーモセットの新生児卵巣を用いて、組織凍結方法の検討を行った。これまでに誘拐後に生存している卵胞があることを確認している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ES細胞から始原生殖細胞を誘導する研究に関しては、成長因子による分化誘の効率が（ヒトやカニクイザルの結果をもとにした）当初の予想よりも低いものであった。このため、ES細胞の培養条件から再検討する必要が生じた。コモンマーモセットはプライム型のES細胞であることから、ナイーブマーカー遺伝子の発現を指標に、シグナル阻害剤の効果をひとつひとつ検討する必要性があった。現在までにナイーブマーカー遺伝子の発現が増強する培養条件を見出すに至った。
ES細胞から生殖巣体細胞を誘導する研究に関しては、マウスを用いた先行研究に時間を要した。当初の予想よりも複雑な遺伝子セットがレポーターとして必要であることが明らかとなり、それらの全てについてノックインによるレポーター細胞を構築した。これらを用いて、マウスにおいての分化誘導条件をほぼ決定することができた。
胎児または新生児の卵巣を器官培養する研究に関しては、材料の入手が当初の予想よりも困難であった。現在構築している入手ルートは育児放棄などで、成長の見込みのない新生児の卵巣を採取する方法である。この方法によりる卵巣の入手の頻度は、予想よりも低いものであった。現在はこれとは異なった複数のルートを構築中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
ES細胞から始原生殖細胞を誘導する研究に関して、ES細胞のナイーブマーカー遺伝子の発現が増強する培養条件を既に決定している。この培養条件は複数のシグナル阻害剤の組み合わせをもつ。この条件で培養されたES細胞はナイーブマーカー遺伝子の発現のほか、BTNG陽性細胞への高い分化傾向をもっていた。今後はこの培養条件を起点とにして始原生殖細胞の誘導条件を検討する。
ES細胞から生殖巣体細胞を誘導する研究に関して、コモンマーモセットES細胞へのレポーターコンストラクトの導入を急ぐ。これまでにコモンマーモセットを用いた高効率のノックイン方法を確立しており、レポーターコンストラクトの導入にはそれほど時間を要さないことが期待される。また分化誘導に関しては、マウスを用いた膨大な基礎データが集められており、これらを有効に活用することにより、コモンマーモセットの生殖巣体細胞の分化誘導を急ぐ。
胎仔または新生仔の卵巣を器官培養する研究に関しては、現在さらに複数の入手ルートを構築中である。また今年度にはこれに従事する人員を補充する予定であり。効果的に凍結・培養方法を検討していく。
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[Journal Article] Embryos and embryonic stem cells from the white rhinoceros.2018
Author(s)
Hildebrandt TB, Hermes R, Colleoni S, Diecke S, Holtze S, Renfree MB, Stejskal J, Hayashi K, Drukker M, Loi P, Groitz F, Lazzari G, Galli C.
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Journal Title
Nat Commun.
Volume: 9
Pages: 2589
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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