2018 Fiscal Year Annual Research Report
CRISPR-mediated 4D nucleome analysis
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17H01407
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
伊藤 隆司 九州大学, 医学研究院, 教授 (90201326)
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2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | CRISPR-Cas9 / Dam / MCP / CRSIPR-Cas12a |
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| Outline of Annual Research Achievements |
前年度に引き続き、塩基修飾を利用して空間的に近接するクロマチン部位を検出するために、dCas9とDamメチレースK9AをsgRNAを介して連結する方策を検討した。検出方法としては前年度に確立したDamID-seq変法を用いて、sgRNA構造の改変を種々試みた。テトラループにMS2ループを挿入してMCP-Dam(K9A)をリクルートすると効率的に標的部位周辺を修飾できることが判明した。そこで、テトラループの更なる延長をウイルス由来のdsRNAを用いて試みた。しかしながら、sgRNAの伸長につれてCas9による切断効率も低下することが認められ、所期の成果を得ることが出来なかった。そこでdsRNAとしての伸長ではなく、CRSIPR-Cas9系の元来の姿であるcrRNAとtracrRNAに分割した上でssRNAとしての伸長を試みているが、現時点ではCas9による切断効率の低下が認められ、所期の成果を得るには至っていない。発現プロモーターの改変等により、更にこの方策の検討を進行中である。一方、昨年までの検討で所期の成果を挙げるに至らなかったdCpf1/dCas12aについては、温度を30℃に上昇させることによって効率が大幅に改善することを見い出した。更に、最近発表された改良型Cas12aであるenAsCas12aのヌクレアーゼ変異体denAsCas12aの有用性も確認され、gRNAの伸長についても有望な結果が得られつつある。
視覚化についてはdCas9と内在性核内因子のBiFCを確立し、更にそのシグナルを増強する新しい手法の原理検証にも成功した。また、上記のdenAsCas12aの視覚化への応用にも成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
dCas9のsgRNAの伸長においては所期の結果が得られなかったが、dCas12aについては有望な結果が得られつつある。視覚化についてもdCas12aとdCas9の併用により、新しい展開の可能性が拡がりつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
空間配置の解析については、denAsCas12aのgRNA伸長の可能性を追求する。視覚化については、dCas9とdCas12aを用いたBiFCを検討する。
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