2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of genome editing platform technology for various disease models
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17H01409
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
山本 卓 広島大学, 理学研究科, 教授 (90244102)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐久間 哲史 広島大学, 理学研究科, 特任講師 (90711143)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 疾患モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は計画に従って、１）単一遺伝子に対して、MMEJを介した一塩基レベルでの改変および、２）複数遺伝子座に対して、同時に異なる蛍光遺伝子のノックインを実施した。
１）に関しては、SNPを導入するために、まず相同組換えによって薬剤耐性遺伝子をノックインした細胞株を作製した。この細胞株から、CRISPR-Cas9システムによって薬剤耐性遺伝子の両端を切断した。その結果、MMEJを介した修復が起こる際に、目的のSNP改変が可能であることが示された。
２）に関しては、３つの標的遺伝子を同時に切断するCRISPR-Cas9のオールインワンベクターと３種類の蛍光遺伝子を含むドナーベクターを作製し、MMEJを介した同時ノックインが可能かどうかを調べた。その結果、３種類の蛍光遺伝子がそれぞれ目的に遺伝子座にノックインされ、遺伝子産物特異的な蛍光の局在を観察することできた。導入された蛍光遺伝子が１種類、２種類および３種類ノックインされた様々なタイプの細胞株を同時に樹立できることが示され。この結果から、MMEJを介した方法によって複数の遺伝子座を同時に改変出来る可能性が示唆された。複数同時ノックイン法はこれまで報告されていないことから、MMEJを用いた有効な方法であると考えられる。さらに、このMMEJでの遺伝子ノックインを促進する因子をスクリーニングし、DNA修復に関する複数の因子を同定することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
単一遺伝子座に対するMMEJを介したSNP改変が確認できていること、および複数遺伝子座への蛍光遺伝子の挿入が成功していることから、当初の計画通りに研究が進展していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
単一遺伝子座で成功したSNP改変法を複数の遺伝子座へ適用するためには、ノックイン効率を上昇させる工夫が必要となる。この工夫としてMMEJ活性を上昇させる因子の同定を並行しておこなってきたので、この因子を過剰発現することによる複数遺伝子座でのノックイン効率化を試みる方針である。
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