2018 Fiscal Year Annual Research Report
Regulation of DNA replication by G-quadruplex and its binding proteins
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17H01418
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 所長 (40229349)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | グアニン４重鎖DNA / 複製タイミング / 染色体高次構造 / 核膜 / RNA-DNAハイブリッド / RecA / RNaseH / 複製開始 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) Rif1とグアニン4重鎖(G4)の相互作用による複製タイミングドメイン形成メカニズム
1) Rif1は多量体を形成し、複数のDNA分子に同時に結合する。2) Rif1のC末179aaにG4結合能、90aaに多量体結合能が存在する。N末HEATリピートもDNA結合能を有するが特異性はやや低い(分裂酵母;動物細胞もほぼ同様)。3) Rif1は核膜画分に強く会合しているが、これはC端29aaに依存する。4) Rif1は、parallelタイプのG4構造に効率よく結合する。5) G4構造は自己集合する性質を有し、Rif1はその会合を安定化する。Rif1がG4に結合することによりクロマチンループを形成するモデルを提唱した。
(2) G4に依存する複製開始のメカニズム
1) 大腸菌染色体の第二の複製開始 (転写と組換え酵素RecA及び複製因子PriAタンパク質に依存)に必要とされるDNA領域(oriT1)にはG4を形成しうる配列が存在する。G4リガンドの複製開始における影響からG4の関与が示唆された。2) PriAタンパク質はG4に結合し、その構造を安定化させる。領域内に新たに同定した機能未知の遺伝子産物YcjDが、第二の複製開始に必要であるとともに、G4特異的に結合することを発見した。3) ColE1系plasmidはRNaseH非存在下でRNA-DNA hybridに依存して複製するが、その際、形成されるG4に複製開始が依存する可能性、薬剤の影響や塩要求性、またデアザグアニンの複製に対する影響等から示唆された。
(3) G4の細胞内動態の解析と新規機能
G4構造、及びそれにより形成されるRNA-DNA hybridを認識するプローブ(BG4抗体、RNaseH1 D145N変異タンパク)を作成し、ChIP-seqにより大腸菌及び分裂酵母において染色体染色体上プロファイルを決定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) Rif1とG4の相互作用による複製タイミングドメイン形成メカニズム
G4結合に必要なRif1タンパク質ドメインを分裂酵母とヒトで決定した。また、その変異体を作製し、その表現型の解析を行っている。Rif1全長及び機能ドメインポリペプチドを精製し、構造解析に着手している。
(2) G4に依存する複製開始のメカニズム
大腸菌第二の複製経路に関与する配列及び、新規因子を同定した。その複製開始はG4に依存することを示唆するdataを得ている。また、plasmid DNAを鋳型とするin vitroの複製系を用いて、RNA-DNA hybridに依存する複製を検出した。
(3) G4の細胞内動態の解析と新規機能の発見
G4及びRNA-DNA hybrid構造の可視化、網羅的マッピングに向けて必要なプローブを作製し、大腸菌及び分裂酵母で予備的な結果を得た。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) Rif1とG4の相互作用による複製タイミングドメイン形成メカニズム
1)Rif1のC端領域に同定された核膜局在、多量体形成、G4結合のそれぞれに必要なアミノ酸を同定し、上記の３つのRif1の機能がクロマチン構造/複製タイミング制御に重要であるか検証する。2)Rif1(全長およびΔIDP)とG4の複合体をクライオ電顕で観察し、その構造を決定する。3)核膜局在のメカニズムを調べる。すでに核膜局在とゲノムワイド複製タイミング制御に重要なCysteine(2450Cys)を同定しており、このCysとの相互作用分子を探索する。
(2) G4に依存する複製開始のメカニズムの解明
1)RNaseH欠損細胞株の抽出液中での複製システムを利用して7デアザグアニンでグアニンを置換した鋳型を作製し、G4を形成しない条件でDNA複製が阻害されるかを検討する。2)RNaseHの温度感受性変異を単離し、これを用いて高温で誘導的に第２の複製系を誘導するシステムを確立する。さらに、樹立した株を用いて複製開始部位を抗BrdU抗体による免疫沈降やコピー数解析で同定する。
(3) G4の細胞内動態の解析と新規機能の発見
1)G4構造のループ領域にI-SceI制限酵素サイトを導入し、制限酵素による切断の可否によりG4形成を検証する。2)G4抗体(BG4)あるいは失活型RNaseHをSNAP-tagに連結し、動物細胞(骨肉腫がん細胞U2OS)で誘導的に発現する細胞株を用いて細胞内G4, RNA-DNA ハイブリッドの動態を観察する（東工大・伊藤由馬博士と共同研究）。3) 1)と2)の方法を用いて、細胞周期における変動、RNaseHの有無、topoisomerase変異、転写阻害、培地の塩の種類、RNA-DNAハイブリッド/G4を分解するRNaseHやG4ヘリカーゼなどの影響を解析する。
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[Presentation] Association of Rif1 with nuclear membrane is essential for genome-wide replication timing regulation2019
Author(s)
Hisao Masai, Yutaka Kanoh, Rino Fukatsu, Seiji Matsumoto, Shunsuke Kobayashi, Hiroyuki Kato, Asami Oji, Sayuri Ito, Naoko Kakusho, Kenji Moriyama, Ichiro Hiratani, Naoko Yoshizawa.
Organizer
Cold Spring Harbor Laboratory Meeting EUKARYOTIC DNA REPLICATION& GENOME MAINTENANCE
Int'l Joint Research
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[Presentation] Biochemical and genetic dissection of Rif1 protein which regulates replication timing through binding to G-quadruplex2019
Author(s)
Masai, H., Kanoh, Y., Matsumoto, S., Fukatsu, R., Kobayashi, S., Kakusho, N.,Sekiguchi, N., Takasawa, K.
Organizer
EMBO Workshop on Fission Yeast/ The 10th International Meeting
Int'l Joint Research
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[Presentation] Genetic analyses of Rif1 protein and G-quadruplexes on the fission yeast genome.2019
Author(s)
Kanoh, Y., Kobayashi, S., Fukatsu, R., Kakusho, N., Matsumoto, S., Takawasa. K.,Masai, H.
Organizer
EMBO Workshop on Fission Yeast/ The 10th International Meeting
Int'l Joint Research
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