2017 Fiscal Year Annual Research Report

KaiC概日時計の動作プログラム：２つのATPaseの協働の生理・生化学的解析

Research Project

Project/Area Number	17H01427
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	近藤孝男名古屋大学, 理学研究科, 名誉教授 (10124223)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	シアノバクテリア / KaiCタンパク質 / 概日時計 / ATPase活性制御 / 機械式概日時計モデル / 時間生物学 / 構造生物化学
Outline of Annual Research Achievements	我々は3つのKaiタンパク質による概日時計の再構成に成功し、極めて特徴的な概日時計の特性（24時間周期と温度補償性）が１日当たり10-20分子のATP分解で達成されていることを見出した。その後、ATPase活性の詳細な解析から、概日時計の特性が２つのATPaseの巧みな分業で達成されるという機械式時計モデルを構築した。本研究ではこのモデルの実体をさらに明確なものにするため、ATPase活性の高精度解析を利用し、これらの機能を担っているタンパク質の内部部位とその動作様式を解明することを目標とした。これによりKaiCタンパク質内に時間測定機構を明らかにすることができよう。平成２９年度には、周期を決定しその温度補償性を実現するATPase協働機構の解明に取り組んだ。このためUPLCを用いた精密測定技術の開発によりCIとCIIのATPase活性の分離解析を確立させ、CI-ATPaseの振動（サイン波）とCII-ATPaseの振動（矩形波）を分離する方法を考案した。さらに、温度補償・周期変異体について、温度やKaiA・KaB量を変化させてATPase活性を精密に測定し、その波形解析を行うことで、２つのATPase活性の評価を確立し、CI-ATPaseとCII-ATPaseについて以下の解析を行った。 CI-ATPase（ペースメーカー）の解析のため、周期変異体の変異KaiCを利用し、そのATPase活性が温度ステップに対する応答過程を解析した。その結果、過渡応答がそのペースメーカーと対応することを明らかにしテンションの実体を解明することを可能にした。一方、CIIのATPaseはリン酸化を駆動し、KaiAKaiB共存下でリズムを発生する。そこで、KaiAの濃度や反応温度を変えた測定を積み重ねることで、リズムの駆動力となるATP消費を素過程レベルで解析した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ２９年度の解析ではKaiCの２つのATPaseの機能解析を行った。高精度UPLCを用いてCIとCIIのATPase活性の分離解析を確立し、KaiCのATPase活性リズムの特徴的な波形を高解像度で捉えることに成功した。次にこの波形をCI-ATPaseの振動（サイン波）とCII-ATPaseの振動（矩形波）を分離する方法を考案し、予測した２つの成分を温度補償や周期の変異体、あるいは温度やKaiA・KaB量を変化させて、ATPase活性を精密に測定し、その波形解析を行うことで、２つのATPase活性の評価法を確立した。この成果は２つATPase機能の組み合わせで概日振動が実現される可能性を示すとともに様々な条件下でモデルの検証を可能とするものである。次にATPase協働機構の解明するため、多くの変異体を検討し、CIとCIIの協働が外れてCII-ATPaseの活性が暴走している変異体を見出した。これらの成果により、先行した研究から取り組んでいる概日時計の機械式時計モデルを実証する実験が可能となり、これまでの細胞レベル遺伝子発現制御に基づいたモデルに代わるモデルの提案が可能となった。また生物発光によるスクリーニングを利用し、CIとCIIの境界面やCIとCIIのリンカー部位に全アミノ酸置換型のランダム変異を導入し、KaiCのCI-CIIカップリングに関与する部位を特定することに成功した。これらの変異体はあらたな時計モデルの実証に貢献することが期待される。さらにCII-ATPaseによるリン酸化サイクル駆動についても調査を開始し、ATPase活性の経時変化とKaiCのリン酸化状態の変遷を高時間分解能で測定し、添加するKaiAの濃度や反応温度を変えた測定を積み重ねることで、リズムの駆動力となるATP消費を素過程レベルで解明する試みを開始した。
Strategy for Future Research Activity	２９年度の研究は順調に推移しているので今後は概日時計の特性を念頭にあらたな時計モデルの検証を進めていく。 1.温度補償性機構の解明: ２９年度にCIとCIIの境界面で新規の温度補償性変異体を得た。この変異体を利用しカップリングの仕組みを解明するためこれらの変異体の生化学的解析を進める。2. CI-CIIカップリングの解析: UPLC法を用いたCIとCIIのATPase活性分離解析を様々な温度条件で検証し、CI-ATPaseの振動とCII-ATPaseの振動が我々のCI-CIIカップリングモデルと一致することを確認した。本年度は「KaiAとKaiBの添加による位相のずれ方」に着目し、安定なリズムが発生する経過を解析し、CI-CIIカップリングの時間的プログラムについて解析する。３. CIIの解析. pHは酵素反応の基礎であり、概日時計の周期決定に大きな影響をもつ。本年度は幅広いpHや温度補償性との関連も知るため、反応液に用いる緩衝液の検討を行ない、様々なKaiAの濃度やpH条件下で周期を調べ、CIIの活性が周期決定に及ぼす仕組みを解明する。４. 位相決定は概日時計の最も重要な機能である。我々の提案する2つのATPase結合モデルは位相決定機構の新たな基礎として重要で、これまで解明出来なかった位相決定の統一的理解を期待させる。そこでKaiCの新しいモデルで位相変位とATPase活性の変動を解析し、同調機構の解明を目指す。５. 高等真核生物のKaiCの探索: ATPaseは生命の最も基本的な酵素であるので、KaiCのような機能をもつATPaseが真核生物にも存在することも考えられる。そこで高等真核生物で機能するP-loopタイプ ATPaseの生化学的探索を行なう。すでにバイオインフォマティクスの研究者の協力で候補も絞り込んだので、タンパク質精製と活性測定を行う。