2017 Fiscal Year Annual Research Report
細胞や生体の恒常性維持に必要な生理的小胞体ストレス応答機構の解明
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17H01468
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
河野 憲二 奈良先端科学技術大学院大学, 研究推進機構, 特任教授 (50142005)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木俣 行雄 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 准教授 (60263448)
都留 秋雄 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教 (80273861)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 小胞体ストレス / 糖尿病 / プロインスリン / 翻訳休止 / 特殊スプライシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（1）膵島β細胞におけるIRE1及びATF6経路活性化の生理的役割
IRE1αを膵島β細胞のみでKOしたマウスから調製樹立した膵島β培養細胞 (MIN6 (Ire1αΔR/ΔR, Atf6α+/+))を用いてインスリンのフォールディング、分泌におけるIre1α の役割を検討したところ、小胞体内でのプロインスリンのPDI familyによるフォールディングが大きく影響を受けることが分かった。そこでPDI familyの中でプロインスリンのフォールディングに関わっていることが予想されたPDI, PDIR, P5, ERp44, ERp46遺伝子すべてをMIN6 (Ire1αΔR/ΔR, Atf6α+/+)に強制発現したところ、プロインスリンの分泌の回復が観察された。さらにIre1α の標的分子であるXBP1s が、これらのPDI family遺伝子上流に結合することを、chIP(chromatin IP)解析により確認した。これらの結果から、膵島β細胞で生理的に小胞体ストレスが高いレベルで活性化しており、この活性化によりその下流の5つのPDIs が高レベルで産生され、プロインスリンのフォールディングを正常に行っていることが明らかとなった。
（2）翻訳休止と連動した新規SRP経路の解析と小胞体ストレス応答
IRE1αの標的因子であるXBP1u mRNAは、XBP1uの翻訳が翻訳休止配列（PS）により休止することにより、その上流にある疎水性領域HR2にSRPが結合し、XBP1u mRNAが小胞体膜のトランスロコンに運ばれることにより、IRE1αによる効率よい特殊スプライシングを受ける。翻訳休止がおきているときにPSはリボソームトンネル内にあり、リボソームタンパク質RPL3, RPL4, RPL7と相互作用していることが、免疫沈降-質量解析により明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2種の膵島β細胞MIN6 (Ire1αΔR/ΔR, Atf6α+/+)、MIN6 (Ire1αfl/fl, Atf6α-/-)細胞はすでに樹立しておりMIN6(Ire1αΔR/ΔR)では、PDI familyの誘導阻害によりプロインスリンのフォールディングがうまくいかないことも明らかとなった。これからIRE1α, ATF6αの2重ノックアウトによる影響をみる予定だが、米国Peter Walter らのグループが取得した ATF6αの特異的阻害剤Ceapinを用いて両者を阻害する実験を共同研究として行っている。また、XBP1uの研究に関しては、リボソームタンパク質RPL3, RPL4, RPL7のノックダウンで、XBP1uの翻訳休止が弱くなることが観察され計画は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
（1）膵島β細胞におけるIRE1及びATF6経路活性化の生理的役割
5つのPDI family (PDI, PDIR, P5, ERp44, ERp46)のうち、どのPDIがプロインスリンのフォールディングに重要なのかを明らかにする。今までに野生型のβ細胞に5種のPDIを同時に発現させると、インスリン分泌が15-20%程度増加することが明らかになっているので、そのアッセイ系を使う予定である。IRE1α、ATF6αの2重KOマウスではさらに顕著なインスリン分泌の抑制が見られる。それをATF6αの特異的阻害剤Ceapinを用いて検討する。
（2）翻訳ポージングと連動した新規SRP経路の解析と小胞体ストレス応答
前年度得られた、相互作用していると考えられるRPL3, RPL4, RPL7のノックダウン実験の再現と、RPL4のリボソームトンネル部分に露出しているアミノ酸に変異を入れ、XBP1uの翻訳休止が解除されるかどうかについても検討を加える。
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[Journal Article] Defective ATG16L1-mediated removal of IRE1α drives Crohn’s disease-like ileitis2017
Author(s)
Tschurtschenthaler M.、Adolph T. E.、Ashcroft J. W.、Niederreiter L.、Bharti R.、Saveljeva S.、Bhattacharyya J.、Flak M. B.、Shih D. Q.、Fuhler G. M.、Parkes M.、Kohno K.、Iwawaki T.、Janneke van der W. C.、Harding H. P.、Smith A. M.、Peppelenbosch M. P.、Targan S. R.、Ron D.、Rosenstiel P.、Blumberg R. S.、Kaser A.
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Journal Title
The Journal of Experimental Medicine
Volume: 214
Pages: 401～422
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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