2018 Fiscal Year Annual Research Report
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17H01519
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
深水 昭吉 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 教授 (60199172)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | RNAメチル化 / 寿命 / tRNA / rRNA / 線虫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は「メチル化反応の修飾基供与体であるS-アデノシルメチオニン (SAM)がメチオニン代謝を経て産生されること」、「翻訳装置の構成因子であるtRNAやrRNAがメチル化されること」、「翻訳活性と生物寿命に相関関係があること」という3点に立脚し、RNAメチル化修飾制御という観点から、栄養情報と生物寿命をつなぐ分子基盤の解明を目指している。
(1) 生体内におけるtRNAとrRNAのメチル化動態を解析するため、線虫個体およびマウス組織から抽出したtotal RNAをアガロース電気泳動によりrRNAとtRNAに分離し、LC-MS/MSによる網羅的なメチル化修飾の解析を行った。独自の分析手法により、10種類以上のメチル化RNAについて同時に比較定量した結果、rRNAのメチル化はそのほとんどがリボースにみられ、逆にtRNAは塩基のメチル化が多くを占めることが明らかになった。
(2) tRNAメチル化酵素をコードするW02A11.1遺伝子を線虫でノックダウンすると、有意な寿命延長と共に、老化に伴う運動の運動能の低下が抑制されることを見出した。
(3) tRNAとrRNAのメチル化が翻訳の効率や選択性に与える影響を評価するため、RNAメチル化酵素をノックダウンした線虫を用いて、Pulse Chase Stable Isotope Labeled Amino Acid Culture法による新規タンパク質合成量の定量比較を行った。
(4) 既知のDNA/RNA脱メチル化酵素の1次構造から、脱メチル化活性をもつと予想される線虫の遺伝子群のノックダウンライブラリーを構築し、上述した解析法と組み合わせて、新規RNA脱メチル化酵素のスクリーニングを行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) 部位特異的なメチル化の解析方法として、メチル化による塩基対の水素結合の低下を指標としたRT-qPCR法、およびメチル化RNA特異的抗体を用いたRNA-IP法を確立済みであり、既にデータを得られ始めている。
(2) 翻訳の効率や選択性を評価する実験系として、線虫を用いたPulse Chase Stable Isotope Labeled Amino Acid Culture法とリボソームプロファイリング法を採用し、解析を進めている。
(3) ゲノム編集技術を用いて線虫W02A11.1遺伝子、およびマウスオルソログのKO個体の作出を試みたが、いずれもホモKOの樹立に至っていない。おそらく同遺伝子を完全に欠失すると耐性致死になると考えられる。現在、マウスについては組織特異的KOマウスを作出中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 固相化した各tRNAの相補DNA配列を用いることで、RNA抽出物から各tRNAを特異的に精製する方法を新たに導入する。なおtRNAの中でも、特に翻訳効率に影響するiMetおよびeMetに焦点を当て、58番目のアデニンの1位のメチル化を中心に解析する。
(2) ショ糖密度勾配遠心によるリボソーム分画法を最近確立しており、今後、rRNAのメチル化とリボソーム粒子の形態との関係性についても検討する。
(3) 翻訳制御因子であるeIF4Eの線虫オルソログife-2や、リボソームタンパク質をコードする遺伝子の変異体を用いたエピスタシス解析により、RNAメチル化を介した翻訳調節と健康寿命の関係性を明らかにする。
(4) RNA脱メチル化酵素に関しては、線虫ノックダウンスクリーニングを推進すると同時に、哺乳類でRNA脱メチル化酵素として報告されたALKBH1の線虫オルソログについて、tRNAのメチル化や寿命への影響を調べる。
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[Journal Article] Tricarboxylic acid cycle activity suppresses acetylation of mitochondrial proteins during early embryonic development in Caenorhabditis elegans2019
Author(s)
Hada,K., Hirota, K., Inanobe, A., Kako, K., Miyata, M., Araoi, S., Matsumoto, M., Ohta, R., Arisawa, M., Daitoku, H., Hanada, T., and Fukamizu, A.
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Journal Title
J. Biol. Chem.
Volume: 294
Pages: 3091-3099
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] KDM5D-mediated H3K4 demethylation is required for sexually dimorphic gene expression in mouse embryonic fibroblasts2019
Author(s)
Mizukami, H., Kim, JD., Tabara, S., Lu, W., Kwon, C., Nakashima, M., and Fukamizu, A.
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Journal Title
J. Biochem.
Volume: 165
Pages: 335-342
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Calreticulin and integrin alpha dissociation induces anti-inflammatory programming in animal models of inflammatory bowel disease2018
Author(s)
Ohkuro M, Kim JD, Kuboi Y, Hayashi Y, Mizukami H, Kobayashi-Kuramochi H, Muramoto K, Shirato M, Michikawa-Tanaka F, Moriya J, Kozaki T, Takase K, Chiba K, Agarwala KL, Kimura T, Kotake M, Kawahara T, Yoneda N, Hirota S, Azuma H, Ozasa-Komura N, Ohashi Y, Muratani M, Kimura K, Hishinuma I and Fukamizu A.
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Journal Title
Nat. Commun.
Volume: 9
Pages: 1982
DOI
Peer Reviewed
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