2018 Fiscal Year Annual Research Report
Production of Daphnia for endocrine disruptor sensing
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17H01880
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
渡辺 肇 大阪大学, 工学研究科, 教授 (80212322)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ミジンコ / エストロゲン / 核内受容体 / レポーター / Gal4 / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
完全長のヒト型エストロゲン受容体のｃDNAをEF1α遺伝子のプロモーターの下流で発現するように設計し、ミジンコに導入した。EF1α遺伝子のプロモーターはミジンコの中でもその転写効率が高いことから、高い発現が期待できる。またレポーター遺伝子としては、上流の制御領域に4回繰り返しのエストロゲン受容体応答配列を有する赤色蛍光タンパク質遺伝子を用いた。これら２種類の遺伝子を、相互に干渉しないよう逆向きにプラスミドに組み込んだDNAを作製し、これをミジンコの卵に微量注入した。CRISPR/Cas9を用いた手法により、ミジンコゲノムに導入しこのDNAを導入することに成功し、トランスジェニックミジンコを作製することができ、この系統がエストロゲンに応答して赤色蛍光を発することを確認した。
一方、核内受容体はリガンド結合領域とDNA結合領域に分離できるだけでなく、DNA結合領域を他の遺伝子の類似領域と入れ替え可能なことが古くから示されている。そこでヒト型核内受容体のリガンド結合領域と酵母由来のGAL４遺伝子のDNA結合領域を融合した遺伝子を作製した。Gal4DNA結合領域は安定してDNAに結合することから、キメラ核内受容体は純粋にリガンド結合部位の応答が解析可能になる。これら核内受容体とGAL4のキメラが実際にミジンコ内で機能することを確認した。レポーター遺伝子としては蛍光タンパク質を用い、レポーター遺伝子の上流の制御領域にはGAL4遺伝子応答配列を挿入した。これにより、リガンド依存的に活性化状態になったヒト型核内受容体が、融合されたGAL4DNA結合領域を介してレポーター遺伝子の制御領域に作用することが可能なミジンコの系統を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
核内受容体とGAL4のキメラ遺伝子の機能については、酵母等で機能することは以前から報告されていたが、今回はじめてミジンコにこのキメラ遺伝子を導入することに成功した。その結果、この導入したキメラ遺伝子が実際にミジンコ内で機能することを確認できた。レポーター遺伝子としては蛍光タンパク質を用いることにより、このキメラ遺伝子の機能を確認することができた。レポーター遺伝子の上流の制御領域にはGAL4遺伝子応答配列を挿入することにより、種々の核内受容体のキメラ遺伝子についての応答を確認できるプラットフォームができたことになる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、核内受容体に作用すると考えられる内分泌かく乱化学物質の検出を容易にするために、生体外の化学物質の作用点としても知られている核内受容体を中心にアンドロゲン受容体、レチノイド受容体、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体、レチノイドX受容体、プレグナンX受容体、構成的アンドロスタン受容体やアリルハイドロカーボン受容体など順次遺伝子導入し、一連の化学物質応答性について検証する。
また実際のフィールドからのサンプル水などを用いて曝露を行い、フィジビリティーについても検証する。
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