2017 Fiscal Year Annual Research Report
プロテオーム解析による有機ハロゲン呼吸細菌の網羅的機能タイピング
| Project/Area Number |
17H01900
|
|---|
| Research Institution | Nagoya Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
吉田 奈央子 名古屋工業大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (10432220)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
野中 里佐 獨協医科大学, 医学部, 講師 (70363265)
押木 守 長岡工業高等専門学校, 環境都市工学科, 准教授 (90540865)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 還元的脱ハロゲン化 / 脱塩素化 / Dehalococcoides / Geobacter / Dehalobacter / 脱塩素化酵素 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
第一に、新規脱ハロゲン化酵素の有機ハロゲン基質の特定テーマにおいて、特に塩素化エチレンの脱塩素化速度が速く、且つ逆転写qPCR結果から既知の塩素化ビニル脱塩素化酵素と異なる脱塩素化酵素遺伝子の存在が示唆されたDehalococcoides属細菌コンソーシアならびに既知株に比べて著しく速い1,2-ジクロロエタンの脱塩素化速度をもつGeobacter sp. AY株について、脱ハロゲン化酵素の租抽出方法を最適化し、Native-PAGE 電気泳動バンドのin gel assayによるバンドの同定を試みた。Geobacter sp. AY株のRDH抽出について、ビーズビーダー法と超音波破砕法を試みた結果、超音波破砕法において、より脱塩素化活性が高い租酵素抽出液を得た。さらに、5種の界面活性剤を用いた租酵素抽出を試みた結果、特にdigitonin、CHAPS、ならびにn-octyl-b-glucosideを用いた租酵素抽出液で脱塩素化活性が高い結果が得られた。これらについてNative PAGEを行い目視で確認できるバンドを切り出し、切り出したバンドを用いて1,2-ジクロロエタンの脱塩素化活性試験を行った。NativePAGEの切り出しバンドの活性試験の結果、CHAPSでは溶解化が完全でないためか720kDa以上のバンド位置で活性が最も高く、n-octyl-b-glucosideでは242-480kDaに存在するバンドにおいて最も高い活性が観察されたものの、より高分子なバンドにも広く脱ハロゲン化酵素活性が観察された。一方、digitoninを用いた場合では、租酵素抽出液の全体的な活性は上記2つの界面活性剤に劣るものの単一のバンドで著しく高いハロゲン化酵素活性が観察されたことから、脱ハロゲン化酵素の分離・同定にはdigitoninを用いた超音波破砕が有効であることが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究代表者が出産のため休暇を取得し一時的に実験・研究の遂行ができなくなったため、脱ハロゲン化酵素のＭＳ分析による同定までを行う予定であったのが、活性バンドの特定にとどまり、特に目標とした新規な脱ハロゲン化酵素の基質同定にまで至らなかった点において、研究にやや遅延がみられる。また、Dehalococcoides属細菌コンソーシアの脱ハロゲン化酵素については、租酵素抽出液の脱ハロゲン化活性を確認することはできたが、Native PAGE ゲル断片における塩素化エチレンの脱ハロゲン化酵素活性を確認するには至っていない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
第一に、in gel assay法で脱ハロゲン化活性が確認されたGeobacter sp. AY株のNative PAGEバンドについてMS分析による同定を行う。また、昨年度、Dehalococcoides属細菌コンソーシアの脱ハロゲン化酵素について租酵素抽出液の脱ハロゲン化活性を確認することはできたが、Native PAGE ゲル断片における塩素化エチレンの脱ハロゲン化酵素活性を確認するには至っていないため、菌体量を増やす大量培養を行った後、ＡＹ株を用いて確立した実験手法に基づきNativePAGEの脱ハロゲン化活性バンドの特定とＭＳ分析により新規な塩化ビニル脱塩素化酵素の同定を目指す。この他、本コンソーシアのメタゲノムデータから基質が同定されていない脱ハロゲン化酵素の機能タイピングを目的として、有機ハロゲンの脱ハロゲン利用性を試験し、活性があった有機ハロゲンの脱ハロゲン化酵素を特定すべくin gel assayならびにNative PAGE活性ゲル断片の特定を順次行っていく。さらに、本コンソーシアより脱ハロゲン化細菌の分離ならびにゲノム解読に取り組むとともに、分離株については生物資源として然るべき分類学的特性評価（至適温度、ｐＨ、塩濃度、電子供与体利用性、順氏受容体利用性試験他）を行った後、微生物保存機関に寄託する。特に塩素化エチレンの脱ハロゲン化細菌であるDehalococcoides属細菌については、浄化微生物製剤としての有用性が期待できること、ならびに同定されていない脱ハロゲン化酵素遺伝子を多く含むことから、ファーメンターを用いた大量かつ高密度培養法を確立するとともに、Dehalococcoides属細菌の増殖ならびに分解速度定数の決定を行う。 また、Dehalobacter 属細菌コンソーシアについても並行して同様の実験に取り組む。
|
Research Products
(1 results)
