次世代シーケンサーを用いた地下水における病原微生物汚染の実態把握とリスク管理

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H01909
• Research Institution: National Institute of Public Health
• Principal Investigator: 秋葉 道宏 国立保健医療科学院, その他部局等, 統括研究官 (00159336)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 原本 英司 山梨大学, 大学院総合研究部, 准教授 (00401141) ; 越後 信哉 国立保健医療科学院, その他部局等, 上席主任研究官 (70359777) ; 小坂 浩司 京都大学, 工学研究科, 准教授 (60370946) ; 三浦 尚之 国立保健医療科学院, その他部局等, 主任研究官 (70770014)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: ウイルス / バクテロイデス / カルバマゼピン / 残留医薬品 / ソーストラッキング / 地下水

Outline of Annual Research Achievements

平成29年度は，地下水試料とマウスノロウイルスを用いた添加・回収実験を行い，効率的なウイルス濃縮条件及び濃縮試料体積を検討した。孔径0.45 μm，直径142 mmの混合セルロースエステル（MCE）膜を用いた陰電荷膜法によってウイルスを濃縮する際は，酸洗浄及びウイルス誘出に用いる硫酸と水酸化ナトリウム溶液の体積をそれぞれ500 mL／45 mLとする条件が，濃縮液の回収率が最も高かった（2.7±1.7%）。濃縮試料体積を20～200 Lと変化させた結果，回収率の幾何平均値は1.8～4.8%であり，試料体積による差は認められなかった。上記の検討条件では，膜からのウイルス誘出操作においてロスがあり，ウイルスがMCE膜に残存することが確認されたため，膜から直接ウイルス核酸を抽出する手法を検討した。その結果，回収率が19～28%となり，安定してマウスノロウイルスを回収することができた。この手法では，MCE膜に物理的に捕捉された細菌の核酸も抽出されるため，同じ核酸抽出試料からウイルスと細菌を検査することが可能となった。開発した手法を実際の水道原水試料（N=21）に適用したところ，1検体からロタウイルスA遺伝子が110 copies/Lの濃度で，別な1検体から反芻動物に特異的なバクテロイデス目細菌遺伝子が52 copies/Lの濃度で検出された。また，新たな糞便汚染指標として原水試料（N=11）中の体表面吸着大腸菌ファージを測定したが，いずれの試料からも検出されなかった。
さらに，収集した原水試料（N=37）を固相抽出により濃縮し，ヒト下水汚染の化学物質マーカーとして提案されているカルバマゼピンの濃度を測定した。その結果，濃度は不検出（<0.6 ng/L）～13.6 ng/Lであり，採水地点によって差が見られた。採水月による変動はほとんど認めらず，有用なマーカーの一つと考えられた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では，国内の地下水における病原ウイルス・病原細菌の汚染実態を把握し，科学的根拠に基づいたリスク管理手法を提案するために，以下の４つのタスクに取り組むこととしている。タスク１：地下水中の病原ウイルス・病原細菌の濃縮手法の確立。タスク２：地下水に対する微生物学的・化学的ソーストラッキング手法の適用性評価。タスク３：国内の地下水における病原ウイルス・病原細菌の汚染実態調査。タスク４：定量的微生物リスク評価に基づく消毒処理における微生物不活化要求量の算定。
平成29年度は，当初の計画通りタスク１及び２の研究を遂行し，地下水試料中のウイルスと細菌を同時に濃縮する手法を考案した。また，タスク３の予備調査として実際の水道原水試料を収集し，開発した手法を適用した結果，陽性率は低いものの，ロタウイルスやバクテロイデス目細菌遺伝子（微生物学的ソーストラッキングマーカー）が検出された。さらに，化学的ソーストラッキングマーカーとしては，残留医薬品類の一つであるカルバマゼピンを測定し，採水地点によって濃度が異なることや月変動が小さいことを確認した。以上の結果から，今年度は実施計画に沿っておおむね順調に研究を遂行することができたと判断した。

Strategy for Future Research Activity

平成29年度に検討した孔径0.45μmの混合セルロースエステル膜を使用した病原ウイルス・病原細菌の同時濃縮手法を用いて，全国の地下水試料の調査を開始する。また，実試料の分析を通じて上記濃縮手法の検証及び微生物学的・化学的ソーストラッキング手法の適用性評価も継続し，調査からのフィードバックを受けながら手法のさらなる改良を行い，最適な手法を随時調査に取り入れる。
地下水試料は，一般細菌や大腸菌，嫌気性芽胞菌等の指標細菌が検出されたことのある全国の浄水場の原水を収集する。調査地点数は15箇所程度とし，頻度は年2回程度とする。病原ウイルスとして，アデノウイルス，アイチウイルス，アストロウイルス，エンテロウイルス，A型肝炎ウイルス，E型肝炎ウイルス，ヒトパレコウイルス，ノロウイルス，ロタウイルス，及びサポウイルスを検出対象とし，病原細菌としては，病原性大腸菌，サルモネラ，カンピロバクター，ビブリオ菌，ウェルシュ菌，レジオネラ菌を対象とする。微生物マーカーとしては宿主に特異的なバクテロイデス目細菌遺伝子，化学物質マーカーとしてはカルバマゼピン等の残留医薬品類を試験する。また，既往の微生物・化学物質マーカーに加え，一般水質項目として大腸菌や濁度等も測定する。病原微生物や微生物マーカーの定量検出には，リアルタイムPCR装置を使用する。さらに，病原ウイルス・病原細菌が陽性の地下水試料に対して次世代シーケンサーを用いてメタゲノム解析を行い，上述した検出対象以外の病原ウイルス及び病原細菌も網羅的に検出し，汚染実態を詳細に調査することを目指す。