Design of Highly EMT-recognizable CarbonateApataite Nano-particles for Organ-Fibrosis and Cancer

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H02104
• Research Institution: Foundation for Advancement of International Science
• Principal Investigator: 赤池 敏宏 公益財団法人国際科学振興財団, その他部局等, 主席研究員 (30101207)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 後藤 光昭 公益財団法人国際科学振興財団, その他部局等, 主任研究員 (80235001) ; 関 禎子 公益財団法人国際科学振興財団, その他部局等, 研究員 (90773309)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 上皮-間葉転換反応(EMT) / カドヘリン / 分子認識 / DDS

Outline of Annual Research Achievements

我々は４０年来、細胞を認識し制御する機能性バイオマテリアルを設計・開発する過程で肝細胞と星細胞あるいは各種上皮細胞と間葉系細胞を認識できる新しいナノバイオマテリアルを開発してきた。同時に、低毒性、高効率な炭酸アパタイトからなる核酸医薬キャリアナノ粒子も開発した。炭酸アパタイトナノ粒子を消化器ガンに対して適用し著しい制ガン効果を確認した（PLoSOne10,e0116022(2015)）。これをふまえ、本研究においては、臓器組織における上皮-間葉転換反応(EMT)を識別できる細胞認識性の各種の糖質高分子とカドヘリンFc キメラ抗体（E-cad-Fc、N-cad-Fc）を上記炭酸アパタイトナノ粒子に付与することでこれまでに無い高効率な線維症治療システムを構築し肝・肺・腎などの主要臓器の炎症、線維症、ガンの画期的な治療DDS 用ナノ粒子システムの開発を目指す。上皮組織崩壊時に発現すると言われているＮ‐カドヘリン分子と、間葉系細胞膜表面に露出するビメンチン、デスミンに注目する。さらに、肝・肺・腎等各種上皮系組織の破損に伴いN－カドヘリンを露出することにも着目して、前述の露出状態を識別するGlcNAc（Ｎ－アセチルグルコサミン）側鎖型糖鎖高分子やN－カドヘリンFc 分子をコーティングした炭酸アパタイトナノ粒子中にＴＧＦ－β等による線維化を抑制する合成医薬ピルフェニドンやsiＲＮＡ等を封入して治療効果を検討する。本プロジェクトは特に肝臓線維症（肝硬変）に注力する。
今回、E-cad-FcとN-cad-Fc上で培養した細胞に差異が見られ、EMT現象の抑制、促進効果が観察された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、炭酸アパタイトナノキャリアーの作製と改良・微細化（30～40nm）及び最適な細胞内取り込みのための条件検討を行い、in vitro（細胞培養条件）でのEMT 現象のモデルを利用した取込解析およびリアルタイム生体イメージング法により臓器内での動態を観察する。一方、コラーゲン線維産生ネットワークのクロストーク解析を行い、siRNA のターゲットを決定する。非アルコール性脂肪肝炎モデル及び誘発肺線維症モデルを用いて効果の確認を行う。また、炭酸アパタイトナノキャリアーの実用化に向けた安全性の評価も行う。という目標を掲げ検討を行った。①炭酸アパタイトナノ粒子の微細化は、糖鎖高分子を最適な条件で混合することにより、200nm以下に調製することができたが、目標の３０～４０nmには、到達できなかった。②EMT現象の検出のため、E-cad-FcとN-cad-Fcを抗体として用い、細胞表面のE-カドヘリン、N-カドヘリンの検出を行い、本研究費で購入させていただいた高性能観察・解析装置であるAll in Oneで画像解析し、EMT現象を起こした細胞ごとの表面状態を解析できた。③E-cad-FcとN-cad-Fcをそれぞれコートしたシャーレ状で、細胞を培養し、その形態や性状を観察した。その結果、EMTの前後で、これらカドヘリンに対する相互作用が大きく異なることが観察された。④肝硬変のキャスティングボードを握る星細胞モデルであるTWNT1に対して、siRNAを内包したキャリアーで殺傷効果を検討した。キャリアーにラクトース、N-アセチルグルコサミンを持つ糖鎖高分子をコーティングしてその効果を検討した。現在のところ、キャリアー単独でも非常に高い殺傷能力を持っていたため、糖鎖の効果は評価できていない。⑤動物での評価は、今回行えなかった。

Strategy for Future Research Activity

前年度行えなかった動物実験を重点的に行う、正常C57BL/6 マウス及びHFCD-DEN モデルでPVGlcNAc 他、キトビオース高分子をコートした炭酸アパタイトの肝臓の星細胞への集積をリアルタイムで観察する。その後肝臓を摘出し、病理組織標本を作製、オステオポエチン等の免疫染色による活性化線維芽細胞とPVGlcNAc 被覆のCAP粒子を確認する。
次の段階として、炭酸アパタイトナノ粒子に対し、EMT 変換をよりリアルに認識すると考えられるE、N、VE カドヘリンの誘導体であるE-cad-Fc、N-cad-Fc、VE-cad-Fc というキメラ抗体をコーティングし、糖鎖高分子での検討と同様に線維症への集積等を確認する。
1）炭酸アパタイト（CAP）ナノ粒子の最適設計（安定化等）とEMT 認識材料（各主要臓器の上皮細胞）、間葉系細胞認識材料のコーティング技術を確立する。
2）各臓器の炎症、ガン等のモデルの製作および構成細胞の分離・培養技術の確立を追求する。前年度で得られた各細胞とその認識材料でコートされた炭酸アパタイト（CAP）ナノ粒子の取り込みと薬理効果を検討する。
3）上皮系細胞であるMDCK 細胞、HepG2 等E－カドヘリンを発現する細胞系を単層培養した上で各種EMT 誘導を作用させ、オールインワン等新たに導入した効率的な蛍光顕微鏡で経時観察をしつつ、EMT 誘導ができるin vitro モデルを確立し、E－カドヘリンFc、ビメンチン、デスミン等の発現を追跡できるシステムを構築する。２９年度実施の各細胞認識性コートをした炭酸アパタイトナノ粒子との相互作用特にターゲティング性能を評価する。

Research Products

• [Journal Article] Radial Glial Fibers Promote Neuronal Migration and Functional Recovery after Neonatal Brain Injury. (2018)
  • Author(s): Jinnou H, Sawada M, Kawase K, Kaneko N, Herranz-Pérez V, Miyamoto T, Kawaue T, Miyata T, Tabata Y, Akaike T, García-Verdugo JM, Ajioka I, Saitoh S, Sawamoto K.
  • Journal Title: Cell Stem Cell. Volume: 22 Pages: 128-137
  • DOI: 10.1016/j.stem.2017
  • Peer Reviewed