脳卒中リハビリテーションにおける薬理的シナプス伝達制御を伴う新たな運動療法の開発

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H02117
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 前島 洋 北海道大学, 保健科学研究院, 教授 (60314746)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 真先 敏弘 帝京科学大学, 医療科学部, 教授 (00585028) ; 榊間 春利 鹿児島大学, 医歯学域医学系, 教授 (10325780) ; 齊藤 展士 北海道大学, 保健科学研究院, 助教 (60301917)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: リハビリテーション / 脳卒中 / シナプス / 神経栄養因子 / 運動

Outline of Annual Research Achievements

脳梗塞モデル動物を対象に運動療法時のGABA作動性シナプス入力の軽度抑制を伴う大脳皮質の易興奮性を薬理的に導入し、この中枢性コンディショニングが虚血損傷脳におけるBDNFの発現とそれに伴うシナプス可塑性、更に運動機能回復に与える影響について精査することが本研究の目的である。本年度はラットMCAO術に基づく脳梗塞右片麻痺モデル作成の再現性の確立とGABAA受容体アンタゴニストであるbicucullineの投与による影響について検証を行った。300－400ｇ体重のSDラットを対象にMCAOフィラメント径の適合の検証を進めた。0.41mm径フィラメントの挿入によって半球全体に渡る脳損傷が生じて致死率は70％を超えた。生存ラットにおいてもその後の運動介入は困難であった。0.37mm径の使用により線状体を中心とするMCO領域の損傷が惹起され、その後のトレッドミル運動が可能な片麻痺モデルの再現的作成が可能となった。更に細い径のフィラメントでは神経学的に片麻痺を呈するモデルの作成は困難であった。そこで、成体げっ歯類に対するbicuculline投与量の精査に基づき、0.37mm径を用いた片麻痺モデルを対象にbicuculline（0.25mg/kg）投与群とそのコントロール群である生理的食塩水投与群を対象に２週間の介入を行い、行動評価として複数の神経学的検査、運動機能検査を行った。bicuculline投与に伴う痙攣発作等の異常所見は観察されず、介入後のTTC染色を用いた組織化学的所見における損傷領域の程度には群間差は認められなかった。一方、介入２週間後のZea Longa Scaleを用いた神経学的障害の評価において、bicuculline投与群はコントロール群と比較して運動機能回復の改善が確認され、GABA作動性シナプス入力の軽度抑制によるコンディショニングの可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

平成２９年度は以下の４項目を研究目標として掲げた。
１．脳梗塞モデル動物の作成：NIH動物実験指針において承認される中大脳動脈閉塞術（middle cerebral artery occulusion, MCAO）によりげっ歯類脳梗塞片麻痺モデル動物を再現的に作成する。２．脳卒中回復期において興奮毒性を呈すことのない安全なGABA受容体アンタゴニストであるbicucullineの投与量を検証する。３．行動評価：運動機能評価として、１）rotarod test、２）wire-hang test、３）beam-walking test等を実施し、走行機能と運動麻痺の程度を定量評価する。更に認知・記憶機能の評価として、新規物体認識試験を実施する。４．虚血損傷領域の評価：行動評価後、全脳を採取し、前額断切片を作成し、TTCにより脳切片を染色し、損傷領域の定量を行う。更に、Nissl染色およびLive/Death viability Cytotocxity Assay kitを用いた蛍光染色により、大脳皮質ペナンブラ領域の神経細胞の細胞死について検証を行う。
このうち、１、２、３の項目については概ね実験を実施できた。一方、モデル動物作成の再現性の獲得に時間を要した結果、４の組織化学的実験においてはTTC染色による脳損傷領域の定位定量評価に留まり、Live/Death viability Cytotocxity Assay kit等を用いた神経細胞死の評価には到達できなかった。このため、引き続き組織化学的精査を継続中である。

Strategy for Future Research Activity

本年度は、bicuculline腹腔内投与と運動の相互作用による機能回復とその要因を検証するため、行動評価に加え損傷側の大脳皮質、特に運動関連領野における損傷領域、周辺ペナンブラ領域、非損傷側大脳皮質運動関連領野を対象に生化学的実験、組織化学実験を実施する。平成29年度に確立したMCAO術に従い右片麻痺モデルラットを作成し、介入要因となるbicuculline腹腔内投与とトレッドミルを用いた運動介入の２要因より４群に群分けし、以下の実験を行う。１．運動機能評価として、Motor behavior test、Neurological Score、rotarod test、Wire hang test、Adhensive removal test、Foot fault test、Cylinder test、sticky tape-removal testを、認知機能評価としてpassive avoidance testを実施し、機能回復レベルを定量評価する。２．全脳を採取し、前額断切片を作成し、TTCにより脳切片を染色し、損傷領域の広がりについて検証を行う。更に、Live/Death viability Cytotocxity Assay kitを用いた蛍光染色により、大脳皮質損傷領域、ペナンブラ領域の神経細胞の細胞死について検証を行う。３．同領域を対象に、リアルタイムPCRを用いたmRNA発現の定量解析により、神経栄養因子BDNFとその受容体、血管内皮細胞増殖因子VEGFとその受容体等のmRNAを測定する。更にELISA法にてこれらターゲット遺伝子の蛋白発現とその下流の細胞内シグナル系であるMAPキナーゼカスケード修飾について定量解析を行う。以上の所見を統合解釈し、脳卒中後の軽度のGABA作動性シナプスの抑制による運動療法に対する効果について検証を行う。