2017 Fiscal Year Annual Research Report
筋萎縮進行におけるプロスタノイドの質量分析イメージング解析と治療標的分子の同定
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17H02157
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
稲田 全規 東京農工大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (80401454)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 克彦 早稲田大学, スポーツ科学学術院, 教授 (80344597)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | スポーツ生化学 / 筋萎縮 / プロスタノイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
平成29年度は筋組織における多分子のプロスタノイド解析に向けた基礎検討として、質量分析イメージングにおけるマトリックス選択、LC-MS解析による定量を同時進行で進めた。今年度の結果を基に次年度の解析項目である発現細胞解析を行う。以下に詳細を示す。
1.精製標品によるLC-MSを用いたプロスタノイド解析: 今年度最適なカラム選定を検討した結果、MS/MS解析により近似分子の同定が可能となった。これによりPGE2の保持時間を決定し、近似質量数を持つプロスタノイドであるPGD2、PGI2、PGF2、PGJ2を含めた複数種の同時定量条件を確立した。
2.筋組織におけるLC-MSを用いたプロスタノイド解析: 尾部懸垂マウスより筋組織を採取し、プロスタノイド測定を行った。その結果、筋組織においてプロスタノイドの産生を検出した。mRNA解析では、炎症性細胞のマーカー遺伝子、そして各プロスタノイドの産生酵素の遺伝子発現を解析した。
3.質量分析イメージングにおけるプロスタノイドのマトリックス選択: プロスタノイドのイオン化マトリックスの決定として、ドライドドロップレット分析を行なった。MALDI-TOF-MS及びMS/MSではポジティブおよびネガティブイオンモードでの詳細な分析を行った。これら試験により、複数種のマトリックスを用いてプロスタノイドのイオン化最適条件の決定と質量分析イメージングの基盤を確立した。
4.質量分析イメージングによる筋組織におけるプロスタノイド解析: 下腿三頭筋および大腿四頭筋の切片作成し、MALDI-TOF-MS解析を行った。質量分析イメージングの解像度と測定ポイントの設定について試験し、プロスタノイドの画像解析を行った。さらに項目1. と2.で得られたLC-MS質量分析の測定結果を併せて解析し、今年度の最終目標である筋組織におけるプロスタノイド解析の基盤構築を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度は、当初計画であった、筋組織における多分子のプロスタノイド解析に向けた基礎検討として、筋組織切片における精製標品を用いた検出法を確立した。
今年度の研究進捗は良好であり、質量分析測定の進展において、カラム選択項目が効率よく進展した背景がある。LC-MSを用いたプロスタノイドの解析では、質量が近似及び一致する分子の分離が必要となる。最適なカラム選定作業として特性の異なる数種を比較検討した結果、MS/MS解析において近似分子の同定が可能となった。これまでに、複数のカラムの長さ、内径、粒子径を可変させ、移動相AとB、および溶媒と流速を可変させたグラジエント分析を可能として、PGE2の保持時間が決定し、測定基盤は確立した。
また、質量分析イメージングでは、プロスタノイドのイオン化に適するマトリックス選択項目が効率良く進んだ。ドライドドロップレット分析では、マトリックス蒸着法を画一化する方式を新たに導入した結果、マトリックス間検出感度の比較解析が可能となり、マトリックス選択の効率が上昇した。これら検討結果を活用し、複数種のマトリックスを用いてプロスタノイドのイオン化最適条件の決定と質量分析イメージングが完成した。
これらの成果は次年度の平成３０年度の本課題を円滑に進める基盤として必須であり、今年度の研究進展は前倒しの課題実施を可能とする。これら理由により、当初の計画以上に進展していると判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成３０年度では、尾部懸垂マウス由来の筋組織を用いた質量分析イメージングを行い、筋萎縮に最も関与するプロスタノイド候補を決定する。In vivo発光イメージャー、３次元マイクロCTを併用し、筋萎縮の表現型とプロスタグランジン発現との相関解析を行う。さらに、炎症性免疫細胞に焦点を当て、細胞表面抗原解析により、プロスタノイドの産生細胞を同定する。
1.In vivoモデル動物を用いた評価系の確立: 対照マウスおよび尾部懸垂マウスを用い、筋萎縮の比較解析実験を行なう。尾部懸垂マウスから1～4週後に後肢の筋肉（大腿四頭筋、下腿三頭筋）を採取する。筋はX線密度測定装置（DEXA法）、マイクロCTによる筋の形態計測と三次元体積解析を実施する。
2.質量分析を用いたエイコサノイドの定量解析: 標準標品の結果をもとに、尾部懸垂マウスより筋組織を採取し、プロスタノイドのLC-MS質量分析を行う。LC分離の後に、筋組織中のプロスタノイドを内部標準法により分析し、尾部懸垂により萎縮する筋組織におけるプロスタノイドの定量を行う。
3.質量分析イメージングを用いた筋組織におけるプロスタノイド解析: 筋切片に最適化したマトリックスを切片上に塗布する。乾燥後に質量分析イメージング装置を用い、尾部懸垂により萎縮する筋組織におけるプロスタノイドの動態解析を行う。
4.プロスタノイド産生細胞の同定と機能相関の解析: 既存の解析技術である、In vivo発光イメージャー、３次元マイクロCTを活用し、筋萎縮の表現型を解析する。これらIn vivo表現型と質量分析イメージングとの相関解析を行う。これら結果を踏まえて炎症性細胞の解析を行ない、筋萎縮におけるプロスタノイド産生細胞を同定する。
平成３０年度の検討により、筋萎縮に関与するプロスタノイドの同定を進め、最終年度におけるプロスタノイド産生阻害薬の投与実験につなげる。
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[Journal Article] Raloxifene reduces the risk of local alveolar bone destruction in a mouse model of periodontitis combined with systemic postmenopausal osteoporosis.2018
Author(s)
Ichimaru R, Tominari T, Yoshinouchi S, Matsumoto C, Watanabe K, Hirata M, Numabe Y, Murphy G, Nagase H, Miyaura C, Inada M
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Journal Title
Arch. Oral Biol.
Volume: 85
Pages: 98-103
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Indoxyl sulfate, a uremic toxin in chronic kidney disease, suppresses both bone formation and bone resorption.2017
Author(s)
Watanabe K, Tominari T, Hirata M, Matsumoto C, Hirata J, Murphy G, Nagase H, Miyaura C, Inada M
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Journal Title
FEBS Open Bio.
Volume: 7
Pages: 1178-1185
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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