2018 Fiscal Year Annual Research Report
DABBファミリー酵素を素材とした新規ポリケタイド閉環酵素の創出
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17H02203
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
森田 洋行 富山大学, 和漢医薬学総合研究所, 教授 (20416663)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 生合成 / 酵素工学 / ポリケタイド / アルカロイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アサ由来オリベトール閉環酵素（OAC）の基質特異性はペンチル結合ポケットによって決定されている。従って、このペンチル結合ポケットの形状を変化させれば、OACの基質特異性を変換し、あらたな化合物を創出できる可能性がある。本年度は、昨年に引き続き、OACのペンチル結合ポケットを構成するアミノ酸に変異を導入することで新規機能を有するOAC機能改変酵素の創出を目指した。その結果、本ポケットの底部のアミノ酸を嵩の低いアミノ酸に変換し、そのOAC変異酵素をヘキサノイルCoAとマロニルCoAを基質としたアロエ由来のⅢ型ポリケタイド合成酵素（PKS）であるオクタケタイド合成酵素の反応液に共存させると、新規アロエソンアナログの生成量が増加することが確認された。その生成量の増加は僅かではあるが、変異を導入したことにより、基質特異性に変化が生じた可能性がある。現在、ブチリルCoAやオクタノイルCoAなどの他の脂肪酸CoAを基質を用いた場合の酵素反応生成物について解析を行っている。
これらと並行して、昨年に引き続き、OACと同一のDABBファミリーに属する植物由来機能未知タンパク質、SP1とAt5g22580の大腸菌での異種発現系の構築を進めた。しかしながら、GST-tag等の様々なtagとの融合タンパク質としての発現や様々な大腸菌種での発現を試みたが，いずれにおいても、SP1とAt5g22580はその多くが封入体を形成し、少量の可溶性タンパク質が得られるのみであった。本研究課題を遂行するためには、不十分な量であるため、現在、さらなるタンパク質発現条件の最適化を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ペンチル結合ポケットの底部に変異を導入したOAC変異酵素において、既知化合物ではあるが、その生産量の向上が見られている。他の基質に対しても機能が変換した可能性が高く、本研究の一つの目的であるOAC の基質特異性の改変に繋がることが大いに期待されることから、総合的に考えて、概ね計画通りに進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
OAC野生型の酵素反応において有望な結果の得られた変異酵素の基質特異性の変換について、酵素反応条件の最適下を進めつつ、詳細にその生成物を精査する。また、その結果次第では、その変異酵素にさらに変異を導入して、OAC変異酵素のみが生産可能な化合物の生産量の増加を狙う。また、大腸菌で発現したSP1とAt5g22580の多くは封入体を形成し、少量が可溶性タンパク質として得られるのみであったため、他の生物での発現を検討する。
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