2017 Fiscal Year Annual Research Report
合成分子と蛋白質を駆使した膜蛋白質の動態解明技術の開発
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17H02210
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
堀 雄一郎 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (00444563)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | PYPタグ / 光架橋 / タンパク質間相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質間相互作用は、シグナル伝達や遺伝子発現をはじめとした様々な生命現象を制御しており、その相互作用を検出する技術の開発は極めて重要である。タンパク質間相互作用を解析するうえで、光架橋剤は、光照射により相互作用する二つのタンパク質を共有結合させることができる強力なツールである。本研究では、細胞膜上のタンパク質間相互作用の検出とその場所を特定することを目的として、PYPタグラベル化技術を利用して、標的タンパク質を特異的に光架橋剤でラベル化し、相互作用するタンパク質を同定するための化学プローブを開発した。
プローブは、蛍光性PYPタグリガンドであるヒドロキシクマリン誘導体に水溶性リンカーを介して光架橋剤を導入することで設計した。光架橋剤として、ジアジリン (DA)、トリフルオロメチルフェニルジアジリン (TPD)およびベンゾフェノン (BP)を組み込んだプローブをそれぞれ合成した。まず、各プローブとPYPタグを反応させ、SDS-PAGEにより解析したところ、ラベル化反応が起こっていることが確認された。次に、PYPタグをラベル化した各プローブがタンパク質間相互作用解析を検出できるかを検証した。モデル実験として、コイルドコイルの相互作用を用い、二つのタンパク質が光架橋されるかを明らかにした。その結果、二つのタンパク質が共有結合で架橋した複合体に由来する蛍光バンドが確認され、各プローブはPYPタグをラベル化し、タンパク質間相互作用を検出できることが示された。
最後に、それぞれのプローブを用いて、膜タンパク質の生細胞蛍光イメージングを行った。その結果、PYPタグを融合した膜タンパク質EGFRをプローブにより特異的に蛍光ラベル化できることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目標に従い、光架橋剤でタンパク質を特異的に標識することができ、また、光照射により、タンパク質間相互作用を検出することに成功した。また、細胞膜という特定の場所で、標的となる特定のタンパク質の相互作用を検出するには、その標的タンパク質を特異的にラベル化する必要がある。実際に、蛍光イメージング実験を行うと、標的タンパク質を発現させた細胞の膜上からのみ蛍光が観測され、特異的にラベル化できたことが示された。以上の結果より、おおむね順調に進展したと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、細胞膜上のタンパク質の相互作用を捉えることができるかを実際に検証する。また、今回の技術は、PYPタグを融合させた標的タンパク質を細胞膜上で捉えることをベースにしている。一方、実際に重要なことは、細胞にもともと存在する内在性のタンパク質の検出技術である。そこで、今後は、内在性膜タンパク質を検出する新たな技術開発を行う。この技術をベースにして、膜タンパク質の相互作用の検出に展開していく。そのためには、内在性の標的タンパク質に特異的に結合するタンパク質ドメインが必要であり、そのドメインを特異的に標識し、標的タンパク質に結合したとき蛍光性となる蛍光色素が必要である。これらの分子を組み合わせることで、内在性膜タンパク質を検出するツールを開発する。
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